葛蓓蕾,陳小讓,徐 霞,張麗蓉

(鄭州大學(xué) 1.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,2.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,3.藥學(xué)院,河南 鄭州 450052)

惡性腫瘤是危害人類健康的嚴(yán)重疾病之一。隨著對(duì)腫瘤形成機(jī)制研究的深入,化療在腫瘤的治療中日益重要。由于傳統(tǒng)的抗腫瘤藥價(jià)格昂貴,且對(duì)機(jī)體均有明顯的毒副作用,因此,研究開發(fā)廉價(jià)、低毒的抗腫瘤藥物已經(jīng)成為了當(dāng)前所面臨的迫切問(wèn)題[1]。本實(shí)驗(yàn)所用新型八核銅配合物乳劑(Nanoporous Octanuclear Cu(Ⅱ),N-Cu)是由本?；瘜W(xué)系無(wú)機(jī)教研室合成的新型銅配合物的納米材料,具有特殊的雙螺旋結(jié)構(gòu)[2]。它是以抗高血壓藥替米沙坦為配體,和8個(gè)銅整合在一起的相對(duì)分子質(zhì)量為8 723的大分子化合物。

在進(jìn)行了急性毒性研究的基礎(chǔ)上,本文用H22模型小鼠對(duì)N-Cu的體內(nèi)抗腫瘤作用進(jìn)行了研究,目的在于探討將其開發(fā)成為廉價(jià)、低毒的抗腫瘤藥物的可能性。

1 材 料

SPF級(jí)昆明種小鼠 90只,體重(20.0±2.0)g,雌性,河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。動(dòng)物生產(chǎn)合格證號(hào):SCXK(豫)2005-0001。普通環(huán)境條件下進(jìn)行該試驗(yàn),溫度 20～22℃,相對(duì)濕度 45%～50%,自由采食和飲水。

順鉑注射液(2mL∶10mg),江蘇豪森藥業(yè)有限公司,批號(hào):20081208;N-Cu,本校無(wú)機(jī)教研室合成。

CJ-2F型醫(yī)用潔凈工作臺(tái),蘇州市馮氏實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)備有限公司;BH-2型倒置顯微鏡,日本 Olympus公司。

小鼠 H22腹水瘤,引自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所,在鄭州大學(xué)藥學(xué)院傳代保存。

2 方 法

2.1 建立穩(wěn)定的H22小鼠腹水瘤模型

按常規(guī)方法,選擇接種 H22后5～7d的健康小鼠,無(wú)菌條件下抽吸腹水,用生理鹽水1∶1稀釋后,顯微鏡下計(jì)活細(xì)胞數(shù),調(diào)整其濃度至1×107個(gè)/mL[3],消毒小鼠的腹部皮膚,用無(wú)菌注射器將 H22腹水瘤細(xì)胞懸液0.5mL,注入小鼠腹腔。以后每5～7d小鼠體內(nèi)傳代 1次,形成穩(wěn)定的傳代體系。大約傳 3～5代即可進(jìn)行試驗(yàn)。

2.2 接種

記錄每只實(shí)驗(yàn)小鼠的體重后,用75%乙醇和碘酒腹部消毒,每只小鼠腹腔注入H22腹水瘤細(xì)胞懸液(含腹水瘤細(xì)胞5×106個(gè))0.5mL。

2.3 分組及給藥

接種次日,隨機(jī)將小鼠分成生理鹽水陰性對(duì)照組、空白乳劑對(duì)照組、順鉑陽(yáng)性對(duì)照組(1.0mg/kg)、低劑量 N-Cu組(0.2mg/mL)、中劑量 N-Cu組(0.4mg/mL)和高劑量 N-Cu組(0.8mg/mL)。每組15只動(dòng)物。接種 24 h后開始給藥。尾靜脈注射0.2mL/10 g給藥治療,1次 /d,連續(xù) 7d。

2.4 檢測(cè)指標(biāo)

稱重荷瘤小鼠在第1,3,5,7天的體重及第1,4,7天的平均采食量,測(cè)量荷瘤小鼠在第1,4,7天的腹圍。第7天給藥后24 h,每組處死 5只小鼠,抽取全部腹水,測(cè)量腹水體積。取心、肝、脾、肺、腎,肉眼觀察并做病理切片。剩余小鼠觀察生存時(shí)間,并計(jì)算生命延長(zhǎng)率。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 13.0 for windows統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析。數(shù)據(jù)以(±s)表示。

3 結(jié) 果

3.1 一般情況觀察

6組小鼠在給藥期間及觀察期內(nèi)未見毛色發(fā)暗、脫毛等;未見驚厥,抽搐。呼吸平穩(wěn),無(wú)異常鼻腔分泌物。便質(zhì)中,量中,無(wú)嘔吐。尿色、尿量正常[4]。給藥 48 h后,N-Cu高、中劑量組出現(xiàn)自主活動(dòng)減少、靜臥不動(dòng),被毛紊亂。順鉑組給藥后出現(xiàn)興奮,消瘦等癥狀。順鉑組第4天死亡 1只,第6天死亡 2只,N-Cu中、低劑量組第6天各死亡 1只,第8天每組處死 5只動(dòng)物并解剖,肉眼觀察心、肝、脾、肺、腎等主要臟器,N-Cu高、中劑量組發(fā)現(xiàn)有腫脹等異常改變,與空白對(duì)照組比較差異顯著。

3.2 N-Cu對(duì)荷瘤小鼠體重的影響

結(jié)果見表1。第4天開始生理鹽水組小鼠出現(xiàn)食欲不振的現(xiàn)象,體重下降明顯;N-Cu高、中、劑量組小鼠飲食正常,體重變化平緩;順鉑組小鼠體重下降較為明顯。從體重來(lái)看,N-Cu各劑量組對(duì)小鼠的生長(zhǎng)均無(wú)明顯的抑制作用。

3.3 N-Cu對(duì)荷瘤小鼠腹圍及腹水量的影響

結(jié)果見表2。給藥后第4天,生理鹽水對(duì)照組、空白乳劑對(duì)照組、順鉑組與N-Cu高、中、低劑量組相比出現(xiàn)腹圍增加;給藥后第7天,生理鹽水對(duì)照組、空白乳劑對(duì)照組與N-Cu高、中、低組相比,腹圍明顯增加,且小鼠出現(xiàn)反應(yīng)遲鈍,行動(dòng)遲緩。順鉑組與N-Cu高、中、低組比較腹圍沒有明顯差異,但小鼠被毛紊亂,精神狀態(tài)相比較差。停藥次日立即解剖收集腹水定量。N-Cu中、低劑量組與生理鹽水組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,N-Cu高劑量組與其它 3組比較均有明顯差異(P＜0.05)。

3.4 N-Cu對(duì)荷瘤小鼠平均采食量的影響

分別測(cè)定6組動(dòng)物的平均采食量,稱重各組給藥后第1,4,7天的飼料量。結(jié)果見表3。

3.5 N-Cu對(duì)荷瘤小鼠生存期的影響

停藥次日即第8天將每組的15只小鼠隨機(jī)取出 9只正常飼養(yǎng)觀察并記錄小鼠的死亡時(shí)間,計(jì)算存活天數(shù)(存活超過(guò) 30 d的按 30 d計(jì)算)及生命延長(zhǎng)率。生命延續(xù)率試驗(yàn)重復(fù) 3份。

表1 N-Cu對(duì)荷瘤小鼠體重的影響(n=15,±s)Tab.1 N-Cu of the body weight of tumor-bearing mice(n=15,±s)

表1 N-Cu對(duì)荷瘤小鼠體重的影響(n=15,±s)Tab.1 N-Cu of the body weight of tumor-bearing mice(n=15,±s)

?

表2 N-Cu對(duì)荷瘤小鼠腹圍和腹水量的影響(n=15, ±s)Tab.2 N-Cu of the abdomen and the amount of ascites of tumor-bearingmice(n=15, ±s)

表2 N-Cu對(duì)荷瘤小鼠腹圍和腹水量的影響(n=15, ±s)Tab.2 N-Cu of the abdomen and the amount of ascites of tumor-bearingmice(n=15, ±s)

與生理鹽水組比較:1P＜0.05Compared with the saline group:1P＜0.05

?

表3 N-Cu對(duì)荷瘤小鼠平均采食量的影響(n=15)Tab.3 N-Cu of the average intake of tumor-bearing mice(n=15)

生命延長(zhǎng)率(%)=(治療組的平均存活天數(shù)/對(duì)照組的平均存活天數(shù) -1)×100%。

結(jié)果見表4。各用藥組較對(duì)照組生存時(shí)間明顯延長(zhǎng)(P＜0.05),生命延長(zhǎng)率在12%～62%之間。對(duì)照組接種后第11天開始出現(xiàn)死亡,至20 d時(shí),對(duì)照組全部死亡,低劑量組有 0只生存(12.1%),中劑量有 2只生存(36.3%),高劑量組有 2只生存(61.5%)。

3.6 病理組織學(xué)觀察

停藥次日即第8天將每組小鼠隨機(jī)取出 5只,解剖取出小鼠的心、肝、脾、肺、腎,稱重,HE染色。用中性福爾馬林液固定,乙醇脫水、二甲苯透明,石蠟包埋、切片,顯微鏡下觀察組織切片。心、脾、肺、腎未見明顯病理變化。肝臟病理切片結(jié)果見圖1。

表4 N-Cu對(duì)荷瘤小鼠生命延長(zhǎng)率的影響(n=9,±s)Tab.4 N-Cu of the life span of tumor-bearingmice(n=9,±s)

表4 N-Cu對(duì)荷瘤小鼠生命延長(zhǎng)率的影響(n=9,±s)Tab.4 N-Cu of the life span of tumor-bearingmice(n=9,±s)

與生理鹽水組相比:1P＜0.05Compared with the saline group:1 P＜0.05

組別 平均存活時(shí)間/d 生命延長(zhǎng)率/%生理鹽水組 15.2±4.4 -乳劑對(duì)照組 15.6±4.0 -低劑量組 17.0±3.01 12.1中劑量組 20.7±4.71 36.3高劑量組 24.5±4.41 61.5

圖1 H22小鼠的肝病理切片(×400)Fig.1 Slice of liver in H22 mice(×400)

生理鹽水對(duì)照組肝組織切片中可見結(jié)節(jié)性病變的部位,其肝細(xì)胞疏松,腫脹,肝竇擴(kuò)張,見癌細(xì)胞浸潤(rùn),癌細(xì)胞異型性明顯,細(xì)胞核大深染,核仁明顯。用藥后,高、中劑量組可見肝細(xì)胞腫脹,核仁明顯,染色質(zhì)豐富,未見明顯異型細(xì)胞。

4 討 論

在對(duì)腹水瘤 H22小鼠體重的影響上,各劑量組與溶劑對(duì)照組相比小鼠體重變化無(wú)明顯差異;與生理鹽水組相比,順鉑對(duì)照組小鼠體重下降明顯?？梢?N-Cu各劑量組對(duì)小鼠的生長(zhǎng)無(wú)明顯的抑制作用,也不因劑量的增加出現(xiàn)體重抑制現(xiàn)象。

在對(duì)腹水瘤 H22小鼠腹圍的影響上,第4天開始生理鹽水對(duì)照組、空白乳劑對(duì)照組、順鉑組與NCu高、中、低劑量組相比出現(xiàn)腹圍增加;第7天生理鹽水對(duì)照組、空白乳劑對(duì)照組與N-Cu高、中、低組相比,腹圍明顯增加,且小鼠出現(xiàn)反應(yīng)遲鈍,行動(dòng)遲緩。順鉑組與N-Cu高、中、低劑量組比較腹圍沒有明顯差異,但小鼠被毛紊亂,精神狀態(tài)相比較差。

由腹水體積得知,高、中、低劑量組腹水體積與生理鹽水組相比都具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05),說(shuō)明該 N-Cu對(duì)腹水的生成具有抑制作用。

從生命延長(zhǎng)率來(lái)看,30 d后對(duì)照組全部死亡,高、中、低劑量組生命延長(zhǎng)率分別為61.5%,36.3%,12.1%。各用藥組與生理鹽水組相比生命延長(zhǎng)率均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。高劑量的N-Cu能明顯延長(zhǎng)生存時(shí)間,但生命延長(zhǎng)率較順鉑略小。

病理組織切片形態(tài)觀察比較可見,用藥后,高、中劑量組可見肝細(xì)胞腫脹,核仁明顯,染色質(zhì)豐富,未見明顯異型細(xì)胞。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,N-Cu具有抗腫瘤作用,明顯改善肝臟環(huán)境,生命延長(zhǎng)率有明顯的延長(zhǎng),但高劑量對(duì)肝臟和心臟有較明顯的抑制作用,低劑量的N-Cu也具有明顯的毒性作用。綜上可知,該新型八核銅配合物乳劑具有抗腫瘤活性,但有一定的毒性。目前我們正做進(jìn)一步研究,以增強(qiáng) N-Cu作用的靶向性,減小其對(duì)肝臟和心臟的毒副作用。該藥物仍處于前期的研究階段,有必要擴(kuò)大樣本數(shù)及增加荷瘤鼠的種類進(jìn)一步研究其抑瘤作用。此外,關(guān)于N-Cu毒副作用及抗腫瘤作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

[1]張壽春.新型含鉑、銅絡(luò)合物抗腫瘤活性與DNA切割活性研究[D].南京:南京大學(xué)博士學(xué)位論文,2004.

[2]齊曉宇.新型金屬銅絡(luò)合物的抗腫瘤作用及機(jī)制研究[D].鄭州:鄭州大學(xué)碩士學(xué)位論文,2009.

[3]徐淑云,卞如濂,陳修.藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)[M].3版.北京:人民衛(wèi)生出版社,2001:1761-1762.

[4]王國(guó)平,雷群芳.雙核銅(Ⅱ)-氟喹諾酮-鄰菲咯啉混配絡(luò)合物的合成、晶體結(jié)構(gòu)和抗腫瘤活性[J].無(wú)機(jī)化學(xué)學(xué)報(bào),2003,19(9):1001-1004.