陳 凌,吳 赟,駱 凱,閆福華

(福建醫(yī)科大學(xué) 1.附屬第一醫(yī)院 口腔科,2.附屬口腔醫(yī)院 牙周科,福建 福州 350004)

牙周膜細(xì)胞(periodontal ligament cell,PDLC)是牙周組織再生修復(fù)的細(xì)胞基礎(chǔ),細(xì)菌內(nèi)毒素(LPS,脂多糖)對PDLC有明顯的細(xì)胞毒作用,因此阻斷LPS對PDLC的破壞對于維護(hù)牙周組織健康有著重要意義[1-3]。

氧化苦參堿(oxymatrine,OMT)是苦豆子、苦參、廣豆根等豆科槐屬植物中生物堿的主要成份。近年來對OMT的研究發(fā)現(xiàn)對多種急性滲出性炎癥具有明顯的拮抗作用,本研究通過細(xì)胞學(xué)研究探討 OMT對LPS作用下的人 PDLC增殖、細(xì)胞周期和超微結(jié)構(gòu)改變的影響,為OMT應(yīng)用于牙周病防治提供參考。

1 材料和方法

1.1 試劑和儀器

OMT(陜西惠科生物工程公司);DMEM培養(yǎng)液、胰蛋白酶、新生牛血清(FBS)(GIBCO,美國);牙齦卟啉菌 LPS(晶美生物工程公司);MTT(Sigma公司)。

CO2孵箱(Heraeus,德國);Humareader酶標(biāo)儀(Human,德國);流式細(xì)胞儀(Coulter公司,美國);透射電鏡(日立 Hu-12A,日本)。

1.2 人 PDLC的體外培養(yǎng)

收集臨床因正畸拔除的前磨牙,要求無齲壞、尖周炎及牙周疾病,牙拔出后即放入裝有無血清DMEM培養(yǎng)液的小瓶中,在超凈工作臺內(nèi)用含有抗生素(青霉素100 u/mL,鏈霉素100μg/mL)的磷酸鹽緩沖液(PBS)反復(fù)沖洗。刮取根中 1/3牙周膜組織,加入含20%FBS的DMEM培養(yǎng)液4mL,在飽和濕度,5%CO2,95%空氣,37℃標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下靜置孵育,待原代人 PDLC細(xì)胞從組織塊周圍游出并鋪滿培養(yǎng)板底 70%左右時(shí),消化傳代。取3～4代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)前對細(xì)胞進(jìn)行免疫組化角蛋白和波形絲蛋白染色,鑒定細(xì)胞起源。

1.3 OMT對LPS作用下人 PDLC增殖的影響

取生長良好的人 PDLC,接種于96孔培養(yǎng)板,每孔 200μL,接種細(xì)胞濃度為1×105/mL,孵育 24 h貼壁后,棄原培養(yǎng)液,PBS清洗 2次加藥,每組設(shè)6個復(fù)孔。分組:空白對照組(僅含1%FBS的DMEM培養(yǎng)液);25μg/mL LPS刺激組;25μg/mL LPS+1,10,25μg/mL OMT刺激組。在24,48,72 h檢測。

終止反應(yīng)前 5 h加入5mg/mL MTT溶液20 μL,繼續(xù)培養(yǎng)4 h,吸棄上清液,每孔加DMSO 150 μL溶解,震蕩 10 min,用酶標(biāo)儀在490 nm波長處檢測各孔吸光度(A)值,每組每孔測 3次取其均值。

1.4 OMT對LPS作用下人 PDLC細(xì)胞周期的影響

取生長良好的人 PDLC接種于200mL培養(yǎng)瓶,孵育 24 h貼壁后棄原培養(yǎng)液,PBS清洗 2次加藥。分組:空白對照組(僅含1%FBS的DMEM培養(yǎng)液);25μg/mL LPS刺激組;25μg/mL LPS+1,10,25μg/mL OMT刺激組。

72 h后每組設(shè)5個平行樣本,生理鹽水2.5mL洗滌 2次(800 r/min離心 5 min),棄上清,加入生理鹽水1mL將細(xì)胞混勻,再加入無水乙醇 2mL立即震蕩混勻,封口膜封口,置4℃冷藏室固定備用。檢測前,800 r/min離心 5min,棄無水乙醇,用生理鹽水洗滌 2次,收取沉淀細(xì)胞(1 000 r/min,10 min),用4℃預(yù)冷 PBS洗 2次,每份標(biāo)本加PI染液,4℃避光染色 l h,200篩網(wǎng)過濾后,將細(xì)胞置氬激光光源,功率為250 mW,激發(fā)波長488 nm條件下進(jìn)行流式細(xì)胞儀測定及聯(lián)機(jī)專用軟件分析處理,計(jì)算各細(xì)胞周期時(shí)相細(xì)胞比例。

1.5 OMT對LPS作用下人 PDLC細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響

取第4代生長良好的人 PDLC接種于200mL培養(yǎng)瓶,孵育 24 h貼壁后棄原培養(yǎng)液,PBS清洗 2次加藥。分組:空白對照組(含1%FBS的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng));陽性對照組(LPS培養(yǎng)24 h后洗去,加培養(yǎng)液再培養(yǎng)48 h);實(shí)驗(yàn)組(LPS培養(yǎng)24 h后洗去,加OMT再培養(yǎng)48 h,OMT終濃度為10μg/mL,LPS終濃度為100μg/mL)。消化收集細(xì)胞,PBS洗滌,1 200 r/min離心 10 min;包埋、聚合:35℃12 h,45℃ 12 h,60℃ 3 d;切片、染色:超薄切片機(jī)切 70～80 nm的超薄切片,經(jīng)醋酸鈾、檸檬酸鉛分別染色5 min,水洗,在透射電鏡下觀察并攝片。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié) 果

2.1 OMT對LPS作用下人 PDLC增殖的影響

結(jié)果見表1。25μg/mL LPS能夠有效地抑制PDLC增殖,其效應(yīng)隨時(shí)間延長而增強(qiáng),各時(shí)相點(diǎn)不同濃度 OMT對LPS抑制PDLC增殖有明顯的拮抗作用,并在一定范圍內(nèi)隨濃度增大而增強(qiáng),LPS組及各實(shí)驗(yàn)組之間均有顯著性差異。

2.2 OMT對LPS誘導(dǎo)的人 PDLC細(xì)胞周期的影響

流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果見表2。與空白對照組相比,LPS培養(yǎng)后,使 DNA合成前期(G1期)細(xì)胞占百分比由48.3%增加至87.3%;相反,DNA合成期(S期)細(xì)胞百分比由39.6%下降至8.3%,兩組之間有顯著性差異(P＜0.05)。OMT干預(yù)培養(yǎng)后,DNA合成前期(G1期)細(xì)胞所占百分比明顯與陽性對照組相比下降,而DNA合成期(S期)細(xì)胞百分比上升,并在一定范圍內(nèi)呈濃度依賴性。

2.3 OMT對LPS作用下人 PDLC細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響

表1 OMT對LPS誘導(dǎo)的人 PDLC增殖的影響(n=6,±s)Tab.1 The effects of oxymatrine on multiplication situation of PDLC under existing LPS(n=6,±s)

表1 OMT對LPS誘導(dǎo)的人 PDLC增殖的影響(n=6,±s)Tab.1 The effects of oxymatrine on multiplication situation of PDLC under existing LPS(n=6,±s)

與對照組比較:1P＜0.05;與LPS組比較:2P＜0.05Compared to control group:1P＜0.05;Compared to LPS group:2P＜0.05

組別 A490 24h 48 h 72 h空白對照組 0.436±0.012 0.576±0.014 0.674±0.023 LPS組 0.186±0.0211 0.264±0.0171 0.338±0.0131 LPS+1μg/mL OMT 0.307±0.0182 0.405±0.0252 0.526±0.0122 LPS+10μg/mL OMT 0.346±0.0252 0.436±0.0322 0.576±0.0272 LPS+25μg/mL OMT 0.361±0.0112 0.485±0.0242 0.596±0.0172

表2 OMT對LPS誘導(dǎo)的人PDLC細(xì)胞周期的影響(n=5,±s)Tab.2 The effects of oxymatrine on cell cycle of PDLC under existing LPS(n=5,±s)

表2 OMT對LPS誘導(dǎo)的人PDLC細(xì)胞周期的影響(n=5,±s)Tab.2 The effects of oxymatrine on cell cycle of PDLC under existing LPS(n=5,±s)

與對照組比較:1P＜0.05;與LPS組比較:2P＜0.05Compared to control group:1P＜0.05;Compared to LPS group:2P＜0.05

組別 細(xì)胞比例/%G1期 S期 G2期空白對照組 48.3±1.6 39.6±1.4 11.4±2.6 LPS組 87.3±2.31 8.3±1.91 4.3±2.2 LPS+1μg/mL OMT 81.7±1.22 15.3±2.72 3.8±2.4 LPS+10μg/mL OMT 55.2±1.12 29.8±1.42 15.4±1.7 LPS+25μg/mL OMT 53.7±1.32 31.3±0.82 14.3±3.5

對照組透射電鏡觀察,細(xì)胞膜表面結(jié)構(gòu)完整、微絨毛較多、核仁明顯、常染色體為主、異染色體位于細(xì)胞邊緣部、胞質(zhì)豐富、細(xì)胞內(nèi)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)數(shù)量較多、線粒體形態(tài)正常、細(xì)胞胞漿外可見分泌的膠原、脂滴,溶酶體少見(圖1～3)。與對照組比較,LPS組超微結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯的變化。主要表現(xiàn)為出現(xiàn)大量腫脹的線粒體、線粒體嵴排列紊亂、胞漿中有自噬小體、其內(nèi)為變性的線粒體,出現(xiàn)髓樣結(jié)構(gòu)、脂滴明顯增多、多見空泡、溶酶體數(shù)量大量增加(圖4)。與LPS組比較加入OMT后線粒體腫脹不明顯,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)無明顯擴(kuò)張,溶酶體數(shù)量也明顯減少,細(xì)胞微絲豐富,微絨毛無明顯腫脹(圖5)。

圖1 對照組(異染色體位于細(xì)胞邊緣部、脂滴,溶酶體少見)(×16k)Fig.1 Control group(Different chromosomes in cells,edge,lipid drops enzyme body rare)(×16k)

圖2 對照組(核仁明顯、線粒體形態(tài)正常)(×20k)Fig.2 Control group(Nuclear benevolence obvious,mitochondria form normal)(×20k)

圖3 對照組(內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體形態(tài)正常)(×25k)Fig.3 Control group(Endoplasmic reticulum,mitochondria normal form)(×25k)

3 討 論

牙周病可造成牙周支持組織的破壞,牙周附著喪失,最終導(dǎo)致牙齒喪失,牙周組織細(xì)胞,包括牙周膜細(xì)胞、成骨細(xì)胞、成牙骨質(zhì)細(xì)胞和未分化的間充質(zhì)細(xì)胞。其中PDLC是一組具有多向分化潛能的異質(zhì)性的多能干細(xì)胞,可分化為成纖維細(xì)胞、成骨細(xì)胞和成牙骨質(zhì)細(xì)胞,在牙周組織再生過程中發(fā)揮重要的作用,是牙周新附著的主要細(xì)胞來源[4]。

LPS具有極其廣泛的生物學(xué)活性 ,能夠引起許多細(xì)胞的生理或病理反應(yīng)。研究表明,在牙周組織慢性炎癥的發(fā)生過程中,LPS通過與血液中和細(xì)胞表面的內(nèi)毒素結(jié)合蛋白(LBP)及內(nèi)毒素受體CD14分子結(jié)合形成復(fù)合物,引起炎性反應(yīng),阻斷 LPS介導(dǎo)的炎性反應(yīng)的破壞對于保護(hù)PDLC有著重要意義[5]。

OMT在中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、抗病毒、抗炎、免疫及抗腫瘤等方面有重要的藥理活性和應(yīng)用前途,各類制劑被廣泛研究并應(yīng)用于臨床[6]。挖掘OMT在牙周發(fā)揮的抗炎及抑制炎癥介質(zhì)的作用可以為牙周病的治療開辟一條新途徑,提供新的思路。

在預(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn) OMT對PDLC的作用是有濃度依賴性的,超過一定濃度范圍,OMT對PDLC有強(qiáng)烈的抑制作用。因此本文選取了1～25μg/mL OMT進(jìn)行實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明不同濃度(1～25μg/mL)OMT對LPS抑制PDLC增殖有明顯的拮抗作用,并在該范圍內(nèi)隨濃度增大而增強(qiáng)。

本研究結(jié)果表明,LPS能夠明顯抑制人牙周膜細(xì)胞的生長與增殖,改變 PDLC細(xì)胞周期各期細(xì)胞所占百分比,使大多數(shù)細(xì)胞更多的停滯在DNA合成前期,而一定量的OMT對LPS刺激下的PDLC具有明顯的保護(hù)作用,并在一定范圍內(nèi)呈量效關(guān)系,對LPS導(dǎo)致的牙周的炎癥反應(yīng)可發(fā)揮相應(yīng)的對抗作用。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)在100μg/mL LPS作用下PDLC超微結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯的變化,主要作用部位為細(xì)胞的生物膜系統(tǒng),對線粒體破壞明顯、脂滴明顯增多、多見空泡、溶酶體數(shù)量大量增加,加入10μg/mLOMT后,LPS導(dǎo)致的細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)損傷明顯減輕,主要表現(xiàn)在線粒體腫脹消失,溶酶體數(shù)量也明顯減少,提示 OMT可阻斷細(xì)菌脂多糖對人牙周膜細(xì)胞的破壞。李鵬等[7]研究發(fā)現(xiàn) OMT等苦豆子生物堿對LPS刺激小鼠腹腔巨噬細(xì)胞和人早幼粒白血病細(xì)胞體外培養(yǎng)上清液及小鼠足腫脹的局部炎癥滲出液中 TNF-α、IL-6和IL-8均具有一定的抑制作用,提示 OMT的抗炎免疫作用可能與其抑制早期致炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生有關(guān)。因此推測 OMT作用的機(jī)制可能是通過降低炎癥介質(zhì)水平以達(dá)到抑制炎癥反應(yīng),防止 LPS對PDLC破壞的目的,但其具體作用機(jī)制還有待深入探討。

圖4 LPS組(脂滴明顯增多、多見空泡、溶酶體數(shù)量大量增加)(×8k)Fig.4 Control group(Lipid drops obviously increase,more empty bubble are seen,the lysosome number increased)(×8k)

圖5 實(shí)驗(yàn)組(溶酶體數(shù)量較少、與LPS組比較超微結(jié)構(gòu)損傷明顯減輕)(×8k)Fig.5 OMT group(The lysosome quantity is less,compared with LPSgroup and the ultrastructure damage is reduced significantly)(×8k)

[1]袁乃梅,馬志偉,萬玲,等.中間普氏菌和脆弱類桿菌內(nèi)毒素對人牙周膜細(xì)胞增殖和超微結(jié)構(gòu)的影響[J].牙體牙髓牙周病雜志,2002,12(8):424-427.

[2]張鳳秋,吳織芬,萬玲.牙周優(yōu)勢菌內(nèi)毒素的生物學(xué)活性及與牙周炎相關(guān)的發(fā)病機(jī)制[J].牙體牙髓牙周病學(xué)雜志,2003,13(3):166-169.

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