高振華 李寧毅 劉鳳芝 荊恒 譚帥 姚如永

骨髓基質(zhì)干細胞片層的制備及其在組織工程骨中應(yīng)用的初步研究*

高振華 李寧毅 劉鳳芝 荊恒 譚帥 姚如永

目的:探討骨髓基質(zhì)干細胞(bonemarrow stromal cells,BMSCs)片層(cellsheet)的制備方法，并觀察其在實驗犬體內(nèi)構(gòu)建組織工程骨時的成骨作用。方法：密度梯度離心法獲取實驗犬骨髓基質(zhì)干細胞，經(jīng)成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)后，利用溫度感應(yīng)性培養(yǎng)皿(tem perature-responsive culture dish)制備細胞片層后在體外包裹犬同種異體脫鈣骨基質(zhì)(dem ineralized bonematrix,DBM),相差顯微鏡和掃描電鏡觀察細胞及片層形態(tài)；將復(fù)合體植入實驗犬背闊肌筋膜下，組織學(xué)方法觀察術(shù)后組織工程骨的骨形成情況。結(jié)果：細胞片層成功制備，并與支架材料復(fù)合良好，術(shù)后16周組織學(xué)顯示形成類似板層骨的致密骨組織。結(jié)論：利用溫度反應(yīng)性培養(yǎng)皿可成功制備BMSC細胞片層，細胞片層包裹支架材料后在實驗動物體內(nèi)可形成具有類似板層骨結(jié)構(gòu)的組織工程骨。

骨髓基質(zhì)干細胞；細胞片層工程技術(shù)；骨組織工程

種子細胞、支架材料和組織構(gòu)建方式是骨組織工程的三大基本要素。近二十年來，骨組織工程在種子細胞、支架材料方面的研究取得了較多的進展[1]，研究者利用各種種子細胞和支架材料獲得了一定大小并具有一定硬度的組織工程骨，但人們更期望獲得具有骨皮質(zhì)和骨松質(zhì)結(jié)構(gòu)的類似天然骨組織的功能性組織工程骨以滿足臨床應(yīng)用時對骨強度的要求。傳統(tǒng)的組織工程骨構(gòu)建方式是將種子細胞懸液接種于支架材料之上，令其粘附、生長、增殖于逐漸降解或吸收的支架材料上并最終形成骨組織，這種方式難以形成類似板層骨的致密骨組織。細胞片層工程技術(shù)(cell sheet engineering)是一種收獲細胞的新技術(shù)，它利用溫度反應(yīng)性培養(yǎng)皿在一定條件下可以無損傷的獲取種子細胞和含有細胞外基質(zhì)(ECM)的一層完整的片狀結(jié)構(gòu)，保護了離子通道、生長因子受體和連接蛋白等重要的細胞表面蛋白[2]。細胞片層通過相互疊加并結(jié)合支架材料可獲得具有3-D結(jié)構(gòu)的組織[3-5]。本文旨在觀察細胞片層的制備及應(yīng)用于骨組織工程時對其成骨的作用。

1.材料與方法

1.1 材料健康雜種犬(青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院動物實驗中心提供)6只，12-18月齡，健康雜種犬股骨(自備)，淋巴細胞分離液(天津，TBD)，DMEM培養(yǎng)基、成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基(含地塞米松、β-甘油磷酸鈉、抗壞血酸等，青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院中心實驗室)，胎牛血清(杭州，四季青)，相差顯微鏡(日本，Olympus IX 50)，CO2細胞培養(yǎng)箱(丹麥，Heto CH 200)溫度反應(yīng)性培養(yǎng)皿(日本，Nunc公司)，掃描電鏡(日本，JEOL JSM－840)超低溫冰箱(日本，SANYO MDF-382E)，冷凍干燥機(美國，SIM FD5508)。

1.2 方法

1.2.1 同種異體脫鈣骨基質(zhì)(dem ineralized bone matrix，DBM)的制備新鮮健康雜種犬股骨，去軟組織、骨膜，于－80℃超低溫冰箱冷凍6個月，經(jīng)脫脂、脫鈣、脫非膠原蛋白，冷凍干燥機冷凍干燥后，制備成1cm×0.6cm大小的扁圓柱狀犬同種異體脫鈣骨基質(zhì)。

1.2.2 骨髓基質(zhì)干細胞(bonemarrow stromal cells，BMSCs)的培養(yǎng)抽取實驗犬髂骨骨髓血，密度梯度離心法分離、提取單個核細胞，將收集到的單個核細胞加入DMEM培養(yǎng)基行原代培養(yǎng)，細胞傳代后換用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)7天，即可制備細胞片層，倒置顯微鏡和鈣結(jié)節(jié)染色法觀察經(jīng)成骨誘導(dǎo)后的細胞形態(tài)。

1.2.3 BMSCs細胞片層的制備將第2代成骨誘導(dǎo)后的BMSCs，以1×106/cm2的密度接種于溫度反應(yīng)性培養(yǎng)皿(Tem perature responsive culture dishes)中，置于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。待培養(yǎng)皿內(nèi)的BMSCs增殖融合達90%左右時，將其置于20℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)20-30分鐘，細胞片層脫落后，倒置顯微鏡和掃描電鏡下行形態(tài)學(xué)觀察。

1.2.4 組織工程骨支架復(fù)合體的構(gòu)建制備好的DBM經(jīng)環(huán)氧乙烷滅菌處理后，放入培養(yǎng)板中，加入DMEM培養(yǎng)液浸泡12h,中間換液一次。術(shù)前1d,無菌紗布吸干DBM水分,0.25%胰蛋白酶消化經(jīng)成骨誘導(dǎo)后的BMSCs制備成細胞密度為1×107個/m L的細胞懸液，然后將DBM輕輕壓縮，在其恢復(fù)形態(tài)同時將細胞懸液滴加于DBM上，直至DBM完全被細胞懸液浸透后，以便細胞被吸入DBM內(nèi)部。將脫落的細胞片層3-5層包裹于支架上，將其置于37℃恒溫、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)備用，掃描電鏡下觀察片層和支架材料的復(fù)合情況。

1.2.5 實驗動物及分組手術(shù)健康雜種犬共6只，雌雄不限，體重20-25kg，靜脈麻醉成功后，暴露實驗犬雙側(cè)背闊肌，將實驗組BMSCs片層/經(jīng)成骨誘導(dǎo)的BMSCs/DBM復(fù)合體和對照組經(jīng)成骨誘導(dǎo)的BMSCs/DBM復(fù)合體植入犬背闊肌肌筋膜下，右側(cè)為實驗組,左側(cè)為對照組。

1.3 倒置顯微鏡和掃描電鏡觀察細胞及細胞片層倒置顯微鏡下觀察細胞的形態(tài)和生長情況，茜素紅染色法檢測鈣結(jié)節(jié)形成。2.5%戊二醛固定細胞片層及支架復(fù)合體行掃描電鏡觀察。

1.4 組織學(xué)觀察于術(shù)后16周取出標(biāo)本，用4%多聚甲醛固定，EDTA脫鈣，脫水，石蠟包埋，橫斷標(biāo)本中央制作切片，HE染色，鏡下觀察骨形成情況。

2.結(jié)果

2.1 形態(tài)學(xué)觀察

2.1.1 骨髓基質(zhì)干細胞原代呈集落樣生長，經(jīng)成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)后細胞由長梭形變?yōu)槎虉A形、立方形，細胞增殖速度減慢，茜素紅染色可見鈣結(jié)節(jié)形成(見圖1)。

2.1.2 將細胞已融合成片的溫度反應(yīng)性培養(yǎng)皿置于20℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細胞逐步從培養(yǎng)皿底分離，20m in時細胞與細胞外基質(zhì)一起脫落可形成完整的細胞片層(見圖2)。

掃描電鏡下可見細胞密集排列形態(tài)、界限不清，細胞呈復(fù)層鱗片狀生長。將形成的細胞片層接種至支架表面后培養(yǎng)3天，掃描電鏡下可見細胞片層良好貼附于支架材料之上，細胞沿支架材料延伸生長(見圖3)。

圖1 骨髓基質(zhì)干細胞經(jīng)成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)后的形態(tài)學(xué)觀察。A.經(jīng)成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)7d后骨髓基質(zhì)干細胞由長梭形變?yōu)槎虉A形、立方形(×100)；B.茜素紅染色示鈣結(jié)節(jié)形成(×100)

圖2 BMSCs細胞片層制備過程的觀察。A.細胞片層脫落后的大體形態(tài)；B.相差顯微鏡下可見細胞自周邊整體收縮并從培養(yǎng)皿底脫落(×40)

2.2 組織學(xué)觀察術(shù)后16周，實驗組新生骨連接成片，植入物邊緣可見類似板層骨結(jié)構(gòu)的致密骨組織形成，部分區(qū)域可見初期的哈佛氏系統(tǒng)(Harvard system)形成；對照組亦有新生骨形成，但無明顯的致密骨結(jié)構(gòu)(見圖4)。

3.討論

傳統(tǒng)的骨組織工程學(xué)在收獲和轉(zhuǎn)移細胞方面仍存在諸多不足，限制了骨組織工程學(xué)的進一步發(fā)展。胰蛋白酶在消化細胞的過程中難以控制細胞的消化程度，造成細胞外基質(zhì)破壞、細胞活性降低和細胞染色體突變機會的增加[6]。單細胞懸液法移植種子細胞的方法，細胞上架率和細胞密度低，難以形成致密的骨組織。因此，骨組織工程學(xué)要構(gòu)建出具有致密骨皮質(zhì)的功能性骨，必須解決種子細胞收獲和轉(zhuǎn)移方面存在的問題。

細胞片層技術(shù)是利用溫度反應(yīng)性培養(yǎng)皿進行種子細胞的收獲和轉(zhuǎn)移的一項新技術(shù)。Yamada,N與Okano等[7]發(fā)現(xiàn)將溫度反應(yīng)性的聚合物，即聚異丙基丙烯酰胺(PIPAAm)共價結(jié)合到普通聚乙烯培養(yǎng)皿表面可形成溫度反應(yīng)性培養(yǎng)皿(tem perature-responsive culture dishes)。在37℃、5%CO2飽和濕度條件下，培養(yǎng)基的表面呈疏水性，細胞可在溫度反應(yīng)性培養(yǎng)皿表面附著、擴展和增殖。當(dāng)培養(yǎng)條件變?yōu)樵?0℃、5%CO2飽和濕度時，PIPAAm由疏水性變?yōu)橛H水性，并在培養(yǎng)皿表面和培養(yǎng)的細胞之間形成水化層，細胞主動從培養(yǎng)基表面脫落形成細胞片層[8]。經(jīng)細胞片層技術(shù)收獲的細胞是含有細胞外基質(zhì)(ECM)的一層完整的片狀結(jié)構(gòu)，含有離子通道、生長因子受體和連接蛋白等重要的細胞表面蛋白[9]，保證了細胞之間的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及相互聯(lián)系，該結(jié)構(gòu)對于構(gòu)建致密組織尤為重要。溫度感應(yīng)性培養(yǎng)皿可用于從干細胞到上皮細胞等多種細胞的培養(yǎng)。近年來，細胞片層技術(shù)在構(gòu)建腎小球、心肌、肝小葉等三維結(jié)構(gòu)組織的研究方面取得了顯著的進展，這為其在骨組織工程中的應(yīng)用打下了良好的基礎(chǔ)。

本實驗采用犬自體骨髓來源的間充質(zhì)干細胞作為種子細胞，它以其來源廣泛、增殖能力強、低免疫原性的特點成為骨組織工程常用的種子細胞。實驗表明，它能在體外經(jīng)誘導(dǎo)向成骨細胞分化，并能粘附、生長于溫度感應(yīng)性培養(yǎng)皿表面，通過溫度變化脫落形成完整的細胞片層。BMSCs片層中的細胞排列緊密，能良好的附著于脫鈣骨基質(zhì)上生長和增殖，類似自然骨質(zhì)形成過程中成骨細胞的排列狀態(tài)。實驗組復(fù)合體植入體內(nèi)后在片層覆蓋部位形成了類似板層骨結(jié)構(gòu)的致密骨組織，并可見初期的哈佛氏系統(tǒng)形成。

細胞片層技術(shù)與傳統(tǒng)骨組織工程學(xué)相結(jié)合可能為骨組織工程的進一步發(fā)展提供契機，但一些問題諸如細胞片層的疊加方式、如何應(yīng)用于大塊骨組織的構(gòu)建等尚需進一步研究。

[1]陳濤，陳立強，李寧毅.富含血小板血漿在頜面組織工程化骨中作用和臨床應(yīng)用的研究進展[J].中華老年口腔醫(yī)學(xué)雜志, 2006,4(4):232-234

[2]Yang J,Yamato M,Shim izu T,et al.Reconstruction of functional tissues w ith cell sheet engineering[J]. Biom aterials,2007,28(34):5033-5043

[3]Nishida K,Yam ato M,Hayashida Y,W atanabe K,et al. Corneal reconstruction w ith tissue-engineered cell sheets composed of autologous oralmucosal epithelium[J].N Eng l Med 2004,351(12):1187-1196

[4]Sh im izu T,Yam ato M,K ikuchi A,Okano T.Cell sheet engineering for myocardial tissue reconstruction[J]. Biom aterials.2003,24(13):2309-2316

[5]Takanori I,Masayuki Y,H iroak i T,et al.Periodontal regeneration w ith mu lti-layered periodontal ligamentderived cell sheets in a caninemodel[J].Biomaterials.2009, 30(14):2713-2716

[6]Trish E,Dimos J,Eggan K.Passaging HuES hum an embryonic stem cell-linesw ith trypsin[J].Vis Exp.2006,12 (1):49

[7]Yamada N,Okano T,Sakai H,et al.Thermo-responsive polym eric surfaces;control of attachm ent and detachm ent of cu ltured cells[J].Mark rom olChem Rapid Comm un.1990,11: 571-576

[8]Kenichi N,Jun K,Teruo O,et al.Tem perature-responsive intelligent interfaces for biomolecular separation[J].R.Soc. Interface.2009,6(3):293-309

[9]Yang J,Yamato M,Nishida K,et al.Cell delivery in regenerative m edicine:the cell sheet engineering approach [J].ControlRelease.2006,116(2):193-203

昆明會議消息

由中華口腔醫(yī)學(xué)會老年口腔專業(yè)委員會主辦，昆明醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院、云南省口腔醫(yī)學(xué)會、解放軍總醫(yī)院聯(lián)合承辦的第六次全國老年口腔醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)研討會擬于2011年4月27日-30日在云南省昆明市召開。會議征文范圍：①近年來老年口腔醫(yī)學(xué)學(xué)科建設(shè)發(fā)展情況總結(jié)；②老年口腔病診療體會；③老年殘冠、殘根保存修復(fù)新技術(shù)、新療法；④老年口腔種植修復(fù)經(jīng)驗；⑤老年口腔相關(guān)學(xué)科新進展。會議期間擬請從事老年口腔醫(yī)學(xué)工作的國內(nèi)外知名專家做專題講座和老年疑難病例研討，并安排與會代表提交的論文做大會交流。歡迎口腔界同行積極投稿，踴躍參會，并請網(wǎng)上投稿。截止日期：2011年3月31日。

聯(lián)系人：儲冰峰chubingf@yahoo.com.cn電話：01066936634郭斌guobin0408@126.com電話：01066936634

中華口腔醫(yī)學(xué)會老年口腔專業(yè)委員會

A prelim inary study on fabrication of BMSCs cellsheetand itsapplication in bone tissue engineering

GAO Zhen-hua,LINing-yi,LIU Feng-zhi,JING Heng,TAN Shuai,YAO Ru-yong.(Department of Oral and MaxillofacialSurgery1,Central Laboratory,Shandong 266003,China)

Objective:This study was designed to investigate the fabrication of bonemarrow stromal cells(BMSCs)sheet and its application in bone tissue engineering.M ethods:BMSCswere derived from dog bonemarrow and cell sheetswere prepared w ith temperature-responsive dishes after cells were osteogenic induced.The sheets were w rapped on demineralized bonematrix(DBM),BMSCsand cell sheetwere observed under invertedmicroscope and scanning electron microscope,then the construct was implanted into the bottom fasciae of latissimus dorsimuscle,bone formation was observed with histological methods after operation.Results:BMSCs sheet was successful prepared and new bone formation w ith high density was observed 16 weeks after operation.Conclusion:BMSCs sheet can be fabricated w ith temperature-responsive culture dishes and it can promote new bone formation w ith sim ilar lamellar structure in bone tissue engineering.

Bonemarrow stromal cells;Cellsheetengineering;Bone tissue engineering

R782.2

A

1672-2973(2010)04-0235-04

2010-04-28)

國家自然科學(xué)基金資助項目(30872896)山東省自然科學(xué)基金資助項目(Y2008C77)

高振華青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院口腔頜面外科碩士生山東266003

李寧毅通訊作者青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院口腔頜面外科主任醫(yī)師教授山東266003

劉鳳芝青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院口腔頜面外科主治醫(yī)師山東266003

荊恒青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院口腔頜面外科碩士生山東266003

譚帥青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院口腔頜面外科碩士生山東266003

姚如永青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院中心實驗室副教授山東266003