劉 琳，付朝霞，劉俊果,*，杜立業(yè)，趙紫華

(1.河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北 石家莊 050018；2.河北省發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，河北 石家莊050018；3.河北科技大學(xué)科研處，河北 石家莊 050018)

表面活性劑沉淀魚精蛋白及復(fù)溶回收過程研究

劉 琳1,2，付朝霞3，劉俊果1,2,*，杜立業(yè)1，趙紫華1

(1.河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北 石家莊 050018；2.河北省發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，河北 石家莊050018；3.河北科技大學(xué)科研處，河北 石家莊 050018)

采用兩種陰離子型表面活性劑：十二烷基硫酸鈉(SDS)和2-乙基己基琥珀酸酯磺酸鈉(AOT)沉淀魚精蛋白并用極性有機(jī)溶劑從沉淀中復(fù)溶回收魚精蛋白。結(jié)果表明：SDS可以完全沉淀魚精蛋白，而表面活性劑AOT最高只能沉淀75.02%的魚精蛋白；極性有機(jī)溶劑的種類及輔助無機(jī)鹽的添加量，對從魚精蛋白-表面活性劑難溶復(fù)合物中回收魚精蛋白有很大的影響；對于SDS-魚精蛋白復(fù)合物，正丙醇為最佳回收劑，魚精蛋白最高回收率可達(dá)83.33%；對于AOT-魚精蛋白復(fù)合物，丙酮為最佳回收劑，魚精蛋白最高回收率達(dá)到85.71%。回收后的魚精蛋白抗菌活性同原始魚精蛋白相比沒有明顯變化。

魚精蛋白；表面活性劑；沉淀；純化

Abstract：The precipitation and recovery of protamine was investigated using ionic surfactants as precipitating ligands and polar organic solvents as recovery agents. Ionic surfactant such as sodium dodecyl sulfate (SDS) exhibited a complete removal of protamine; however, sodium di-(2-ethylhexyl) sulfosuccinate (AOT) exhibited only 75.02% removal of protamine. In addition,an obvious effect of organic solvent and salt amount on the recovery of protamine from its precipitate. As for SDS-protamine precipitate,n-propanol was the optimal solvent with protamine recovery rate of more than 83.33%. As for AOT-protamine precipitate, acetone was the optimal solvent with protamine recovery rate of more than 85.71%. Compared with original protamine, no significant change in antibacterial activity of recovered protamine was observed.

Key words：protamine；surfactant；precipitation；purification

從傳統(tǒng)的觀點(diǎn)來看，表面活性劑是一種蛋白質(zhì)變性劑。然而據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，用表面活性劑在一定條件下與木聚糖酶[1]、胰凝乳蛋白酶[2]、溶菌酶[3]等蛋白質(zhì)形成沉淀，從而沉淀蛋白質(zhì)，然后用某些有機(jī)溶劑溶解復(fù)合物，再在溶劑中添加一些無機(jī)鹽，可以使蛋白質(zhì)重新沉淀下來，而表面活性劑仍然溶解于有機(jī)溶劑中。采用表面活性劑沉淀法提取的蛋白質(zhì)，水復(fù)溶性好，活性基本可以保持。與反膠團(tuán)法萃取蛋白相比，它具有表面活性劑用量少的優(yōu)點(diǎn)[1-4]。圍繞表面活性劑沉淀法提取蛋白質(zhì)的研究報(bào)道很少，尚需進(jìn)一步深入。魚精蛋白是一種富含精氨酸的堿性蛋白，相對分子質(zhì)量大約在4000～10000之間，其中鮭魚的魚精蛋白為4070[5]，而鯉魚的魚精蛋白大約為15320[6]。在食品工業(yè)上可以作為天然防腐劑使用[7-11]，臨床上可以作為胰島素的載體，延長胰島素的半衰期，還用于肝素注射過量引起的出血。本實(shí)驗(yàn)針對表面活性劑沉淀魚精蛋白及其復(fù)溶回收過程展開研究，以探索采用表面活性劑沉淀法提取魚精蛋白的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

鮭魚硫酸魚精蛋白 上?？笊锛夹g(shù)有限公司。

十二烷基硫酸鈉(SDS，化學(xué)純) 天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；2-乙基己基琥珀酸酯磺酸鈉(AOT，分析純) 美國Sigma公司。

752型紫外-可見分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司；HYG-IIB型搖瓶柜 上海欣蕊自動(dòng)化設(shè)備有限公司；SW-CJ-2FD型潔凈工作臺 蘇凈集團(tuán)安泰公司制造；H1650型高速臺式離心機(jī) 長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 考馬斯亮藍(lán)法測定魚精蛋白質(zhì)量濃度

配制考馬斯亮藍(lán)試劑以及約0.25mg/mL魚精蛋白溶液，按下述方法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：分別取0.25mg/mL魚精蛋白溶液0、40、80、120、160、200μL于試管中，然后加去離子水至200μL。分別加入5mL考馬斯亮藍(lán)溶液，混勻，靜置10min，在595nm處比色，以吸光度為橫坐標(biāo)，魚精蛋白質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[12]。線性回歸方程為y＝0.1853x－0.0046，回歸系數(shù)R2為 0.9923。

1.2.2 魚精蛋白抑菌活性的測定[13-14]

以枯草芽孢桿菌為檢測菌。配制牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基：牛肉膏0.6g、蛋白胨2g、NaCl 1g、水200mL、調(diào)pH7.4～7.6；其固體培養(yǎng)基的配制：增加瓊脂4g。

以100mL三角瓶，裝入18.5mL液體培養(yǎng)基，加入1.5mL菌懸液(對照組為去離子水)，再加入2mL蛋白質(zhì)樣品水溶液，混勻后在37℃恒溫培養(yǎng)箱中以180r/min振蕩培養(yǎng)24h。取培養(yǎng)液，在波長600nm處比色，以O(shè)D600nm表示細(xì)胞量[13-14]。抑菌率的計(jì)算如式(1)，重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明抑菌率測定的相對誤差為7%。

1.2.3 表面活性劑AOT、SDS沉淀魚精蛋白

將魚精蛋白溶于去離子水中，配成1.15mg/mL的蛋白溶液。將0.5～20mL SDS溶液(2mmol/L)或0.5～12mL AOT溶液(3mmol/L)加入到5mL蛋白溶液中，充分振蕩后靜置反應(yīng)30min，10000r/min離心5min，收集上清液。取上清液200μL，測定魚精蛋白的質(zhì)量濃度，繼而算出沉淀率。同時(shí)檢測沉淀過程中pH值的變化。

式中：ρ0為初始魚精蛋白質(zhì)量濃度；ρ1為上清液中殘留的魚精蛋白質(zhì)量濃度。

1.2.4 蛋白質(zhì)-表面活性劑沉淀中回收魚精蛋白

取5mL的蛋白溶液(1.15mg/mL)，加入一定體積的表面活性劑溶液，充分振蕩后反應(yīng)30min，于10000r/min離心5min，棄去上清液，取沉淀，加入一定體積有機(jī)溶劑(丙酮、95%乙醇或正丙醇)，充分混勻，8000r/min離心10min，取上清液，加入一定量的氯化鈉或硫酸鈉溶液(0.1mol/L)。充分振蕩反應(yīng)10min，再于10000r/min離心5min，然后倒掉上清液，得沉淀即為提取后的魚精蛋白。用去離子水將其復(fù)溶。取溶液1mL稀釋適當(dāng)倍數(shù)，測定魚精蛋白質(zhì)量濃度。魚精蛋白質(zhì)量濃度的測定誤差約為3%，蛋白質(zhì)沉淀率的誤差為

1.2.5 魚精蛋白抑菌活性回收率的測定

選取質(zhì)量濃度為0.15mg/mL左右的魚精蛋白溶液原溶液與回收溶液，測定其抑菌率。由于實(shí)驗(yàn)過程中回收蛋白溶液和原始魚精蛋白溶液的體積相等，因此抑菌活性回收率的計(jì)算見式(4)。抑菌活性回收率的相對誤差為

2 結(jié)果與分析

2.1 表面活性劑AOT、SDS沉淀魚精蛋白

2.1.1 表面活性劑加入量對魚精蛋白沉淀率的影響

圖1 SDS、AOT加入量對魚精蛋白沉淀率的影響Fig.1 Effect of SDS/AOT ratio on precipitation of protamine

從圖1可以看出，隨SDS加入量的增多魚精蛋白的沉淀率增加，并且能夠達(dá)到100%；隨AOT加入量的增多魚精蛋白的沉淀率先增大然后又減小，最高沉淀率達(dá)到75.02%；較低濃度的AOT與蛋白質(zhì)反應(yīng)就可得到較高的沉淀率，1.5×10-3mmol AOT就可得到56.26%的沉淀率，而1.6×10-2mmol SDS才能得到53.03%的沉淀率。

分析認(rèn)為，表面活性劑引起蛋白質(zhì)沉淀，可能是由于當(dāng)表面活性劑濃度在極低(小于0.1mmol/L)到接近CMC(臨界膠團(tuán)濃度)之間時(shí)，蛋白質(zhì)分子結(jié)合了一定的SDS或AOT后，中和了蛋白質(zhì)所帶的相反符號的電荷，并同時(shí)引入了疏水鏈(表面活性劑的烷基鏈)，大大降低了水化能，同時(shí)蛋白質(zhì)分子上的SDS/AOT疏水基團(tuán)之間存在疏水性相互作用，導(dǎo)致大量蛋白質(zhì)相互聚集而產(chǎn)生沉淀[15-16]。

2.1.2 SDS、AOT加入量對魚精蛋白溶液pH值的影響

圖2 SDS-AOT加入量對上清液pH值的影響Fig.2 Effect of SDS-AOT ratio on pH of supernatant after reaction

從圖2可以看出，隨著SDS、AOT加入量的增大沉淀量增多，上清液的pH值逐漸升高，最高達(dá)到3.89左右。

實(shí)驗(yàn)中使用的是硫酸魚精蛋白，為強(qiáng)酸弱堿鹽，其水溶液呈酸性。當(dāng)只加入少量表面活性劑時(shí)溶液的pH值較小，接近3.15。隨著魚精蛋白沉淀量的增加，游離的魚精蛋白減少，溶液的pH值也隨著逐漸上升。

2.2 回收魚精蛋白

2.2.1 不同回收劑對蛋白質(zhì)回收率的影響

從SDS-魚精蛋白難溶復(fù)合物中回收魚精蛋白時(shí)，以正丙醇作為回收劑，將正丙醇加入到沉淀物中并充分振蕩以后沉淀物完全溶解，加入NaCl后有片狀懸浮物生成，離心后管底有較多沉淀物，離心除去上清液，加入水后沉淀物完全溶解；以丙酮作為回收劑，丙酮加入到沉淀物中并充分振蕩以后只有少量沉淀物溶解，加入NaCl后沉淀物也無明顯變化，再次離心去除丙酮加入水溶解時(shí)沉淀物還是不能完全溶解。以95%乙醇作為回收劑，乙醇加入到沉淀物中并充分振蕩以后沉淀物完全溶解，加入NaCl后有微量懸浮物，離心后管底有少量沉淀物，倒去丙酮后，加入去離子水，沉淀物完全溶解；而從AOT-魚精蛋白難溶復(fù)合物中回收魚精蛋白，過程與前面類似，以正丙醇作為回收劑，正丙醇加入到沉淀物中并充分振蕩以后沉淀物完全溶解，加入NaCl后有少量懸浮物生成，離心后管底有少量沉淀物，去正丙醇加入水后沉淀物完全溶解。以丙酮作為回收劑，丙酮加入到沉淀物中并充分振蕩以后沉淀物完全溶解，加入NaCl后有片狀懸浮物生成，離心后管底有較多沉淀物，去丙酮加入水后沉淀物完全溶解。

圖3 回收劑種類對 SDS-魚精蛋白難溶復(fù)合物回收率的影響Fig.3 Effect of organic solvent species on recovery rate of protamine from SDS/protamine precipitate

圖4 回收劑種類對AOT-魚精蛋白難溶復(fù)合物回收率的影響Fig.4 Effect of organic solvent species on recovery rate of protamine from AOT/protamine precipitate

從圖3可以看出，對于SDS-魚精蛋白難溶復(fù)合物，正丙醇為最佳回收劑，魚精蛋白最高回收率可達(dá)83.33%；以95%乙醇作為回收劑時(shí)的回收率最高值為7.908%；丙酮作為回收劑的最高回收率也只能達(dá)到56.68%。從圖4可知，對于AOT-魚精蛋白難溶復(fù)合物，丙酮為最佳回收劑，最高回收率達(dá)到85.71%，而以正丙醇作為回收劑最高回收率只達(dá)到32.19%。輔助無機(jī)鹽的添加量對蛋白質(zhì)的回收有顯著的影響。無機(jī)鹽的加入是為了平衡有機(jī)相中的電荷，破壞難溶復(fù)合物之間的靜電力，從而使蛋白與表面活性劑分離。

回收魚精蛋白的方法是使表面活性劑-魚精蛋白難溶復(fù)合物溶解于有機(jī)溶劑中，然后加入鹽使魚精蛋白從有機(jī)溶劑中沉淀出來，而表面活性劑留在有機(jī)相中。沉淀出來的蛋白質(zhì)很容易通過過濾或離心從有機(jī)相中分離，而表面活性劑通過簡單的蒸餾就可回收[2]。當(dāng)SDS溶液加入到魚精蛋白溶液中并充分振蕩后溶液出現(xiàn)乳白色沉淀；隨SDS加入量的增加乳白色沉淀增加，溶液的乳白色減弱，溶液越來越澄清透明。而AOT加入到魚精蛋白溶液中并充分振蕩后溶液中出現(xiàn)的沉淀量較少，隨AOT加入量的增多沉淀量也隨之增加。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)用丙酮作為回收劑時(shí)，SDS-魚精蛋白難溶復(fù)合物不能完全溶解于丙酮中；換用95%乙醇做回收劑，雖能夠完全溶解難溶復(fù)合物，但加入鹽離心后只有微量魚精蛋白析出；正丙醇既能完全溶解難溶復(fù)合物，加鹽離心后也能使魚精蛋白分離出來；丙酮可像正丙醇那樣使AOT-魚精蛋白難溶復(fù)合物完全溶解，然而，加入鹽后魚精蛋白更容易從丙酮中析出。因此，作為SDS-魚精蛋白難溶復(fù)合物最好的回收劑是正丙醇，而作為AOT-魚精蛋白難溶復(fù)合物最好的回收劑是丙酮。

2.2.2 回收劑中加入不同種類的鹽對蛋白回收率的影響

圖5 不同鹽對SDS-魚精蛋白難溶復(fù)合物中魚精蛋白回收率的影響Fig.5 Effect of salt on recovery rate of recovery rate of protamine from SDS/protamine precipitate

從經(jīng)濟(jì)角度考慮，國內(nèi)少有AOT，故使用SDS表面活性劑沉淀魚精蛋白。由圖5可知，無論使用氯化鈉還是硫酸鈉都可使回收率達(dá)到80%以上，對魚精蛋白回收率的影響相差不大。隨鹽加入量的增多回收率升高，當(dāng)加入0.30mmol的鹽溶液時(shí)，回收率最高，繼續(xù)提高加鹽量，會導(dǎo)致魚精蛋白回收率下降。

2.2.3 回收后魚精蛋白抑菌活性測定

表1 魚精蛋白抑菌活性回收率Table 1 Antibacterial activity of recovered protamine studied using various organic solvents

表1是3種不同方式制得3種蛋白回收液與原蛋白溶液的抑菌活性比較，考慮到抑菌活性回收率的相對誤差為9.8%左右，而3種魚精蛋白回收液的極差為3%，所以認(rèn)為回收后的蛋白質(zhì)抑菌活性與初始的魚精蛋白相比沒有明顯變化。

3 結(jié) 論

研究SDS、AOT沉淀魚精蛋白的效果，并用極性有機(jī)溶劑從沉淀中復(fù)溶回收魚精蛋白。結(jié)果表明：SDS可以完全沉淀魚精蛋白，而表面活性劑AOT最大只能沉淀75.02%的魚精蛋白。極性有機(jī)溶劑的種類及輔助無機(jī)鹽的添加量，對從魚精蛋白-表面活性劑難溶難溶復(fù)合物中回收魚精蛋白有很大的影響。對于SDS-魚精蛋白難溶復(fù)合物，正丙醇為最佳回收劑，魚精蛋白最高回收率可達(dá)83.33%。對于AOT-魚精蛋白難溶復(fù)合物，丙酮為最佳回收劑，魚精蛋白最高回收率達(dá)到85.71%?；厥蘸蟮聂~精蛋白抗菌活性同原始魚精蛋白相比，沒有明顯變化。這些結(jié)果說明，采用表面活性劑沉淀提取魚精蛋白從技術(shù)角度是完全可行的。以此為基礎(chǔ)，本實(shí)驗(yàn)室將進(jìn)一步研究采用表面活性劑沉淀法從鯉魚魚精蛋白粗提液中純化提取魚精蛋白。

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Surfactant Precipitation and Recovery of Protamine

LIU Lin1,2，F(xiàn)U Zhao-xia3，LIU Jun-guo1,2,*，DU Li-ye1，ZHAO Zi-hua1
(1. College of Bioscience and Bioengineering, Hebei University of Science and Technology, Shijiazhuang 050018, China；2. R&D Center for Fermentation Engineering of Hebei Province, Shijiazhuang 050018, China；3. Department of Scientific Research, Hebei University of Science and Technology, Shijiazhuang 050018, China)

TQ932

A

1002-6630(2010)13-0056-04

2009-11-12

河北省教育科學(xué)研究計(jì)劃項(xiàng)目(2006315)；河北科技大學(xué)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目(2006JC-13)

劉琳(1982—)，男，碩士研究生，研究方向?yàn)樯锓蛛x工程。E-mail：lll3316693@163.com

*通信作者：劉俊果(1968—)，女，副教授，博士，研究方向?yàn)樯锓蛛x工程。E-mail：happyliu1997@yahoo.com.cn