袁春龍，張 金

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.陜西省葡萄與葡萄酒工程技術(shù)研究中心，陜西 楊凌 712100)

纖維素酶和果膠酶對(duì)番茄紅素提取的影響

袁春龍1,2，張 金1

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.陜西省葡萄與葡萄酒工程技術(shù)研究中心，陜西 楊凌 712100)

以番茄組織為材料，用含體積分?jǐn)?shù)2%二氯甲烷的石油醚為提取溶劑，研究添加果膠酶和纖維素酶提取番茄紅素的實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，果膠酶和纖維素酶混合使用比單一酶的提取效率高，且果膠酶的提取效果比纖維素酶要好。在果膠酶和纖維素酶混合質(zhì)量比為2:1時(shí)，提取番茄紅素的最佳條件為A3B2C2D4，即混合酶用量0.6g/100g、酶解溫度35℃、pH5.0、酶解時(shí)間5h，然后2%二氯甲烷的石油醚提取20min，4000r/min離心10min。因此，添加果膠酶和纖維素酶，用2%二氯甲烷的石油醚提取，可以提高番茄紅素的提取率。

番茄紅素；纖維素酶；果膠酶

番茄紅素(lycopene)是一種在動(dòng)植物體中廣泛分布的類胡蘿卜素(carotenoids)，呈紅色，因最先發(fā)現(xiàn)于番茄中而得名。過去番茄紅素由于不具備VA的活性，而被認(rèn)為是一種不重要的類胡蘿卜素，一直未被重視。然而，近年來，隨著人們健康意識(shí)的提高，以及新的科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，研究人員發(fā)現(xiàn)番茄紅素具有抗氧化、消除人體自由基、防癌、抗癌[1-3]、抗衰老、預(yù)防心血管疾病[4-5]、防輻射及紫外線、提高男性生育能力等多種生理功能，其抗氧化性在類胡蘿卜素中最強(qiáng)，防癌、抗癌的效果明顯優(yōu)于α-和β-胡蘿卜素(carotene)，是一種很有發(fā)展前途的功能性天然色素[5-6]。

目前，我國(guó)番茄紅素的生產(chǎn)和研究均處于起步階段，其生產(chǎn)工藝上主要有浸提法[7-8]、酶反應(yīng)法[9]和超臨界CO2流體萃取法[10-12]、高速逆流色譜法、微波輻射萃取法及利用工程菌株發(fā)酵法生產(chǎn)番茄紅素[13-14]。浸提法常用有機(jī)溶劑乙酸乙酯、氯仿等；酶反應(yīng)法采用外加纖維素酶等來提高番茄紅素的提取速度和提取量；超臨界CO2流體萃取法具有能耗低、無毒、易回收、可低溫處理等優(yōu)點(diǎn)，得到的番茄紅素?zé)o異味，無溶劑殘留，提取番茄紅素的收率可達(dá)90%以上，但成本過高，不適合大規(guī)模生產(chǎn)；高速逆流色譜法、微波輻射萃取法及利用工程菌株發(fā)酵法，仍處在實(shí)驗(yàn)研究階段。本實(shí)驗(yàn)通過外源添加果膠酶、纖維素酶，研究混合酶用量及其比例、酶促反應(yīng)的溫度、pH值及酶解時(shí)間對(duì)番茄紅素提取率的影響，并通過正交試驗(yàn)獲得提取番茄紅素的最佳工藝，為合理充分利用番茄資源，提取番茄紅素提供科學(xué)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

番茄(新鮮、成熟) 楊凌某農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。

果膠酶(酶活力≥10萬(wàn)U/g) 天津市酶制劑廠；纖維素酶(酶活力≥8萬(wàn)U/g) 上海東風(fēng)生化技術(shù)有限公司；85%磷酸、96%氫氧化鈉、99%二氯甲烷、石油醚(沸程60～90℃)(均為分析純) 西安化學(xué)試劑廠。

高速組織搗碎機(jī) 深圳泰康達(dá)科技有限公司；PH-29A型酸度計(jì) 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；恒溫電熱水浴鍋 北京長(zhǎng)風(fēng)儀器儀表廠；SP2102UV紫外-可見光光度計(jì) 上海江星儀器有限公司；離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；恒溫水浴鍋 北京泰克儀器公司。

1.2 方法

新鮮番茄清洗并稱其質(zhì)量，在100℃左右的水浴中熱燙去皮，然后用高速組織搗碎機(jī)打漿，打到無大的片狀、團(tuán)狀物為止。在85℃的水浴鍋中鈍化20min，并且不時(shí)用玻璃棒攪拌，然后冷卻至室溫備用。

1.2.1 果膠酶和纖維素酶單獨(dú)使用提取番茄紅素的實(shí)驗(yàn)

稱取20g鈍化后的番茄汁，分別裝在5個(gè)250mL的帶塞三角瓶中，加入果膠酶0.2、0.4、0.6、0.8、1.0g/100g，40℃酶解4h，冷卻至室溫，再用含體積分?jǐn)?shù)2%二氯甲烷的石油醚浸提20min，取上層油相過濾后4000r/min離心10min，上清液在波長(zhǎng)472nm處測(cè)定吸光度，以確定果膠酶的最佳用量。再按上述方法確定纖維素酶的最佳用量。

1.2.2 果膠酶和纖維素酶混合比例的確定

稱取20g鈍化后的番茄汁，分別裝在5個(gè)250mL的帶塞三角瓶中，加入果膠酶和纖維素酶質(zhì)量比3:1、2:1、1:1、1:2、1:3，總酶量為0.8g/100g，于40℃酶解4h，冷卻至室溫，再用含2%二氯甲烷的石油醚浸提20min，取上層油相過濾后4000r/min離心10min，上清液在波長(zhǎng)472nm處測(cè)其吸光度，以確定混合酶的最佳比例。

1.2.3 果膠酶和纖維素酶混合用量的確定

稱取20g鈍化后番茄汁，分別裝在5個(gè)250mL的帶塞三角瓶中，在最佳比例下，分別加入總酶量0.2、0.4、0.6、0.8、1.0g/100g，于40℃酶解4h，冷卻至室溫，再用含2%二氯甲烷的石油醚浸提20min，取上層油相過濾后4000r/min離心10min，上清液在波長(zhǎng)472nm處測(cè)其吸光度，確定最佳混合酶用量。

1.2.4 果膠酶和纖維素酶混合使用時(shí)pH值的確定

稱取20g鈍化后的番茄汁，分別裝在5個(gè)250mL的帶塞三角瓶中，調(diào)整pH值依次為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0，在一定的混合酶最佳比及其用量，于40℃酶解4h，冷卻至室溫，再用含2%二氯甲烷的石油醚浸提20min，取上層油相過濾后4000r/min離心10min，上清液在波長(zhǎng)472nm處測(cè)其吸光度，確定最佳pH值。

1.2.5 果膠酶和纖維素酶混合使用時(shí)酶解時(shí)間的確定

稱取20g鈍化后的番茄汁，分別裝在6個(gè)250mL的帶塞三角瓶中，加入一定的混合酶最佳比例及其用量，于40℃酶解2、3、4、5、6、7h，冷卻至室溫，再用含2%二氯甲烷的石油醚浸提20min，取上層油相過濾后4000r/min離心10min，上清液在波長(zhǎng)472nm處測(cè)其吸光度，確定酶解的最佳時(shí)間。

1.2.6 果膠酶和纖維素酶混合使用時(shí)酶解溫度的確定

稱取20g鈍化后的番茄汁，分別裝在4個(gè)250mL的帶塞三角瓶中，加入一定的混合酶最佳比例及其用量，分別在30、35、40、45℃條件下酶解4h，冷卻至室溫，再用含2%二氯甲烷的石油醚浸提20min，取上層油相過濾后4000r/min離心10min，上清液在波長(zhǎng)472nm處測(cè)其吸光度，確定酶解的最佳溫度。

1.2.7 果膠酶和纖維素酶酶解最佳提取條件的確定

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，確定果膠酶和纖維素酶的質(zhì)量比為2:1，通過混合酶用量、酶解溫度、酶解pH值、酶解時(shí)間4個(gè)主要因素，進(jìn)行四因素四水平的L16(44)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)(表1)，以確定酶解提取番茄紅素的最佳條件。

表1 果膠酶和纖維素酶提取番茄紅素的正交試驗(yàn)Table 1 Factors and levels in the orthogonal array design

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，數(shù)據(jù)取平均值，采用Excel處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 果膠酶、纖維素酶單獨(dú)用量對(duì)番茄紅素提取的影響

由圖1可見，單獨(dú)使用果膠酶酶解提取番茄紅素時(shí)，隨著酶用量的增多，吸光度逐漸增大，說明番茄紅素的提取量逐漸增加，果膠酶最佳用量是0.8g/100g；而纖維素酶隨著酶用量的增加，提取量先升高，而后逐漸下降，最佳用量是0.4g/100g，而且果膠酶的效果比纖維素酶好。

2.2 果膠酶和纖維素酶混合比例對(duì)番茄紅素提取的影響

圖4 pH值對(duì)番茄紅素提取的影響Fig.4 Effect of pH on lycopene extraction

圖2 果膠酶和纖維素酶混合比例的確定Fig.2 Effect of pectinase/cellulase ratio on lyopene extraction

由圖2可知，隨著果膠酶和纖維素酶的比例的逐漸降低，吸光度也逐漸下降，比例越低，其吸光度亦越低，說明果膠酶對(duì)番茄紅素的提取作用明顯；二者的比例在3:1、2:1時(shí)的吸光度相差不多，從成本上考慮，選擇最佳比例為2:1。

2.3 混合酶用量對(duì)番茄紅素提取的影響

圖3 混合酶用量對(duì)番茄紅素提取的影響Fig.3 Effect of total dosage of pectinase and cellulase on lycopene extraction

由圖3可見，果膠酶和纖維素酶以2:1的比例混合均勻，隨著混合酶總量的增多，吸光度緩慢升高，至1.0g/100g達(dá)到最大，但和0.6g/100g相比，只相差0.013，故選擇最佳用量為0.6g/100g。

2.4 pH值對(duì)番茄紅素提取的影響

由圖4可知，在果膠酶和纖維素酶最佳比例2:1，用量0.6g/100g，40℃酶解4h，隨著提取液pH值的升高，吸光度先上升后下降，當(dāng)pH5.0時(shí)，吸光度最大，說明番茄紅素的提取量最高，故選擇最佳pH值為5.0。

2.5 酶解時(shí)間對(duì)番茄紅素提取的影響

圖5 酶解時(shí)間對(duì)番茄紅素提取的影響Fig.5 Effect of hydrolysis time on lycopene extraction

由圖5可知，果膠酶和纖維素酶的比例2:1，用量0.6g/100g，在40℃、pH5.0條件下提取番茄紅素，隨著酶作用時(shí)間的延長(zhǎng)，吸光度迅速增加，當(dāng)達(dá)到4h時(shí)，再延長(zhǎng)酶解時(shí)間，其吸光度趨于穩(wěn)定，所以酶解時(shí)間確定為4h。

2.6 酶解溫度對(duì)番茄紅素提取的影響

圖6 酶解溫度對(duì)番茄紅素提取的影響Fig.6 Effect of hydrolysis temperature on lycopene extraction

由圖6可見，果膠酶和纖維素酶的比例2:1，用量0.6g/100g，pH5.0，酶解4h，隨著酶解溫度的升高，吸光度先升高再下降，在35℃時(shí)達(dá)到最大，故選擇酶解溫度為35℃。

2.7 果膠酶和纖維素酶提取番茄紅素的最佳工藝

根據(jù)表2正交試驗(yàn)結(jié)果可知，果膠酶和纖維素酶以2:1混合，提取番茄紅素的最佳工藝組合是A3B2C2D4，即混合酶用量0.6g/100g、酶解溫度35℃、pH5.0、酶解5h，然后用含2%二氯甲烷的石油醚提取20min，4000r/min離心10min，所得的提取液番茄紅素最高。由表3方差分析結(jié)果表明：影響番茄紅素提取效果的順序大小依次為B＞D＞C＞A，即影響最大的是酶解溫度，其次是酶解時(shí)間和pH值，最小的是果膠酶和纖維素酶的酶用量。

表2 果膠酶和纖維素酶提取番茄紅素的正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Orthogonal array design arrangement and experimental results

表3 顯著性分析表Table 3 Results of significance tests

3 結(jié)論與討論

番茄紅素是一種開鏈?zhǔn)降牟伙柡秃}卜素，由8個(gè)異戊二烯單體組成，分子式為C40H56，有順式和反式兩種異構(gòu)體，在植物中存在的番茄紅素幾乎都是反式的，而在動(dòng)物體內(nèi)存在的番茄紅素，順式異構(gòu)體占的比例較大。順式異構(gòu)體比反式更容易被吸收，加熱可以使反式的番茄紅素轉(zhuǎn)變成順式的，以便利于被吸收利用。由于番茄紅素是一種脂溶性色素，不易滲透穿過細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，很難從細(xì)胞壁中溶出，應(yīng)用酶解破壞細(xì)胞壁可以有效地促使各種化學(xué)物質(zhì)從植物組織中釋放出來，包括油脂類[16]、非揮發(fā)性葡萄香氣物質(zhì)[17]、胡蘿卜素[18]等物質(zhì)，提高其提取率。Lavecchia等[19]應(yīng)用果膠酶、纖維素酶、半纖維素酶等處理，在40℃酶解1h，然后加入有機(jī)溶劑(丙酮、乙醇、乙酸乙酯、環(huán)己烷)提取3h，提取率達(dá)到77%～98%，而對(duì)照只需3%～30%。Choudhari等[15]應(yīng)用果膠酶和纖維素酶酶解方法提取番茄紅素，認(rèn)為果膠酶的效果比纖維素酶好的多。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用含2%二氯甲烷的石油醚為提取溶劑，研究果膠酶和纖維素酶單獨(dú)使用和復(fù)合使用對(duì)番茄紅素提取的影響，結(jié)果顯示果膠酶和纖維素酶混合使用比單一酶的提取效率高，而且果膠酶的提取效果比纖維素酶要好。在果膠酶和纖維素酶質(zhì)量比為2:1時(shí)，混合使用這兩種酶提取番茄紅素的最佳條件為混合酶用量0.6g/100g、酶解溫度35℃、pH5.0、酶解時(shí)間5h，然后用2%二氯甲烷的石油醚提取20min，4000r/min離心10min。影響番茄紅素提取效果最大的是酶解溫度，其次是酶解時(shí)間和pH值，最后是果膠酶和纖維素酶的用量。

關(guān)于混合酶用量影響最小的具體原因還不清楚，可能有以下幾個(gè)方面：1)酶的加入僅僅是為了破壞細(xì)胞壁，促進(jìn)番茄紅素的溶出，一般認(rèn)為，細(xì)胞壁破壞越嚴(yán)重，番茄紅素的溶出就越容易。但并不一定提取的番茄紅素就越高，它還與其提取的溶劑、提取溫度、提取次數(shù)、提取時(shí)間等因素有關(guān)[19]；2)在酶促反應(yīng)中，當(dāng)?shù)孜餄舛冗h(yuǎn)遠(yuǎn)大于酶濃度時(shí)，隨著酶添加量的增加，反應(yīng)速度加快；當(dāng)?shù)孜锶勘幻附Y(jié)合，酶用量再大，反應(yīng)速度不再變化；所以，當(dāng)酶用量過大時(shí)，提取率與酶用量沒有相關(guān)性；3)酶的活力不同，對(duì)番茄紅素提取的影響也不同。不同的廠家，酶的純度、活性大小是有所差別的；4)不同的番茄組織，酶用量也不相同。對(duì)于整個(gè)番茄果實(shí)，用4～6g/100g纖維素酶和0.25～4g/100g果膠酶處理，結(jié)果顯示6g/100g的纖維素酶和0.5g/100g的果膠酶處理獲得的番茄紅素最高，分別為96.3μg/g和90.6μg/g；3g/100g的纖維素酶處理果皮，番茄紅素的產(chǎn)量最佳為424μg/g，而2g/100g的果膠酶處理最好，為712μg/g[15]；5)當(dāng)酶的添加量比較少時(shí)，影響酶促反應(yīng)的因素可能就是酶促反應(yīng)的溫度、時(shí)間和pH值。此外，為了打漿方便，本實(shí)驗(yàn)對(duì)果實(shí)進(jìn)行了去皮處理，由于番茄皮中含有較多的番茄紅素[20]，必將影響番茄紅素的提??；另外本實(shí)驗(yàn)只用提取液吸光度的大小反映提取效果，沒有具體含量和提取率，這是本研究的不足之處。

[1] WILLCOX J K, CATIGNANI G L, LAZARUS S. Tomatoes and cardiovascular diseases[J]. Critical Review in Food Science and Nutrition,2003, 43(1): 1-18.

[2] ZHAO Yaping, QIAN Suping, YU Wenli, et al. Antioxidant activity of lycopene extracted from tomato paste towards trichloromethyl peroxyl radical CCl3O2[J]. Food Chemistry, 2002, 77(2): 209-212.

[3] ARAB L, STECK S. Lycopene and cardiovascular disease[J]. American Journal of Clinical Nutrition, 2000, 71(6): 1691S-1695S.

[4] 邱建生, 張彥雄, 劉鐵柱, 等. 國(guó)內(nèi)外番茄紅素的研究與生產(chǎn)現(xiàn)狀[J].中國(guó)食品添加劑, 2000(2): 83-85.

[5] 俞蓮娣. 漸受關(guān)注的番茄紅素[J]. 中國(guó)制藥信息, 2004, 20(11): 20-22.

[6] LEVY J, BOSIN E, FELDMAN B. Lycopene is a more potent inhibitor of human cancer cell proliferation than either alpha- carotene or betacarotene[J]. Nutrition and Cancer, 1995, 24(3): 257-266.

[7] 劉慧, 閻樹剛. 功能性番茄紅素的提取生產(chǎn)技術(shù)[J]. 農(nóng)產(chǎn)品加工, 2003(6): 16-17.

[8] 趙功玲, 婁天軍. 提高粗制品番茄紅素提取率的工藝[J]. 食品工業(yè),2003(3): 32-33.

[9] 李士雨. 番茄紅素的提取與合成工藝研究進(jìn)展[J]. 中草藥, 2003, 34(1): 2-3.

[10] 孫新虎, 李偉. 超臨界流體萃取技術(shù)在番茄紅素提取中的應(yīng)用[J]. 中國(guó)食品添加劑, 2003(1): 69-72.

[11] BAYSAL T, ERSUS S, STARMANS D A. Supercritical CO2extraction ofβ-carotene and lycopene from tomato paste waste[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2000, 48(11): 5507-5511.

[12] SABIO E, LOZANO M, de ESPINOSA V M, et al. Lycopene andβcarotene extraction from tomato processing waste using supercritical CO2[J]. Industrial Engineer Chemical Research, 2003, 42(25): 6641-6646.

[13] 趙功玲, 婁天軍. 微波酶法提取番茄紅素效率的影響研究[J]. 食品與機(jī)械, 2003, 20(1): 8-10.

[14] 楊鈴, 寧正祥. 番茄紅素提取工藝研究進(jìn)展[J]. 糧油食品科技, 2004,5(12): 44-45.

[15] CHOUDHARI S M, ANANTHANARAYAN L. Enzyme aided extraction of lycopene from tomato tissues[J]. Food Chemistry, 2007, 102(1):77-81.

[16] DOMINGUEZ H, NUNEZ M J, LEMA J M. Enzymatic pretreatment to enhance oil extraction from fruits and oil seeds[J]. Food Chem, 1994, 49(3): 271-286.

[17] SADLER G, DAVIES J, DEZMAN D. Rapid extraction of lycopene and beta-carotene from reconstituted tomato paste and pink grape fruit homogenates[J]. Journal of Food Science, 1990, 55(5): 1460-1461.

[18] SANTAMARIA R I, REYES-DUARTE M D, BARZANA E, et al.Selective enzyme-mediated extraction of capsaicinoids and carotenoids from chilli guajillo puya (Capsicum annuumL.) using ethanol as solvent[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2000, 48(7):3063-3067.

[19] LAVECCHIA R, ZUORRO A. Improved lycopene extraction from tomato peels using cell-wall degrading enzymes[J]. Eur Food Res Technol,2008, 228(1): 153-158.

[20] SHARMA S K, LE MAGUER M. Lycopene in tomatoes and tomato pulp fractions[J]. Journal of Food Science, 1996, 8(2): 107-113.

Synergic Effects of Cellulase and Pectinase on Extraction of Lycopene from Tomato

YUAN Chun-long1,2，ZHANG Jin1
(1. College of Enology, Northwest A&F University, Yangling 712100, China；2. Shaanxi Engineering Research Center for Viti-Viniculture, Yangling 712100, China)

In the extraction of lycopene from tomato, petroleum ether containing 2% (V/V) dichloromethane was used as extraction solvent. Lycopene extraction was investigated with respect to the effects of respective and synergic hydrolysis of tomato by cellulase and pectinase. The results indicated that a higher extraction yield of lycopene was obtained when pectinase,instead of cellulase was used for hydrolyzing tomato. More lycopene was extracted from tomato using both of the enzymes than using pectinase alone. The optimal parameters for extracting lycopene using both of the enzymes were determined as follows:pectinase/cellulase ratio 2:1, their total dosage 0.6 g/100 g, and pH 5.0 for 5 h hydrolysis at 35 ℃, followed by extraction for 20 min using the above extraction solvent and centrifugation at 4000 r/min for 10 min.

lycopene；cellulase；pectinase

TS255.4

A

1002-6630(2010)13-0100-05

2009-12-09

楊凌農(nóng)業(yè)科技開發(fā)基金項(xiàng)目(2004TA21)

袁春龍(1969—)，男，副教授，博士，研究方向?yàn)槠咸雅c葡萄酒功能性成分。E-mail：yuanchunlong@hotmail.com