魯健章，孫麗華，周彥鋼*

(浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院保健食品研究所，浙江 杭州 310013)

凱氏定氮法測定魚蛋白質(zhì)含量的干擾因素分析

魯健章，孫麗華，周彥鋼*

(浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院保健食品研究所，浙江 杭州 310013)

為了使凱氏定氮法更適于魚蛋白質(zhì)含量測定，針對魚肉中非氨基酸態(tài)氮和魚類氮換算蛋白質(zhì)的系數(shù)進行分析，并探討凱氏定氮法測定魚蛋白質(zhì)的可行的改進措施。

凱氏定氮法；魚蛋白；氮換算蛋白質(zhì)的系數(shù)；非氨基酸態(tài)氮

Abstract：In order to improve the accuracy of Kjeldahl method for the determination of fish protein, the conversion factor between amino acid nitrogen and non-amino acid nitrogen in fish protein is analyzed and a series of feasible improvement strategies for the determination of fish protein by Kjeldahl method are discussed in this paper.

Key words：Kjeldahl determination；fish protein；conversion factor；non-amino acid nitrogen

凱氏定氮法是目前使用最為廣泛、經(jīng)典的蛋白質(zhì)含量測定方法，也是蛋白質(zhì)檢驗的國家標(biāo)準(zhǔn)方法。該方法操作簡單，測定結(jié)果重復(fù)性和重現(xiàn)性好，廣泛應(yīng)用于各種食品、飼料、水產(chǎn)等行業(yè)的蛋白質(zhì)含量測定。蛋白質(zhì)中含有一定比例的氮元素，氮元素含量與蛋白質(zhì)的含量存在一定的轉(zhuǎn)換關(guān)系，即氮換算蛋白質(zhì)的系數(shù)，F(xiàn)[1]。凱氏定氮法首先測定樣品中氮的質(zhì)量，再乘以F值即為樣品中的蛋白質(zhì)質(zhì)量。

通常情況下，蛋白質(zhì)含氮量在16%左右，其F值為6.25。但是，實際上不同來源的蛋白質(zhì)的氨基酸組成差別很大，含氮量的差別也很大，如乳制品、面粉、花生的蛋白質(zhì)含氮量分別為15.67%、17.54% 和18.32%，則它們的F值分別為6.38、5.70和5.46[1]。對于魚類蛋白而言，國家標(biāo)準(zhǔn)中沒有列出其F值，研究人員普遍引用肉及肉制品的F值(6.25)來計算其蛋白質(zhì)含量。但作者在研究魚肉蛋白過程中多次發(fā)現(xiàn)，按此系數(shù)計算所得的蛋白質(zhì)含量常常遠高于魚肉酸水解氨基酸的總量，魚蛋白粉的蛋白含量測定結(jié)果往往超過100%。最初作者認(rèn)為誤差源自不準(zhǔn)確的蛋白質(zhì)系數(shù)(6.25)，所以在現(xiàn)有的文獻基礎(chǔ)上計算了魚肉蛋白含氮量并推導(dǎo)了F值，結(jié)果顯示魚肉蛋白含氮量在14%左右，絕大部分魚蛋白的真實F值在7.0～7.5之間。然而如果根據(jù)此系數(shù)計算魚肉蛋白質(zhì)含量則勢必造成計算結(jié)果更大的偏離。經(jīng)初步分析，筆者判斷該誤差源自魚肉中存在的非氨基酸態(tài)氮(non-amino acid nitrogen，NAN)，如氧化三甲胺及其分解產(chǎn)物、尿素、生物堿等，它們的存在虛高了魚肉的蛋白質(zhì)含量。

為了使凱氏定氮法能夠準(zhǔn)確的測定魚肉及魚肉制品中的蛋白質(zhì)含量，并客觀、真實的評價魚蛋白質(zhì)的營養(yǎng)價值，本文針對氮換算蛋白質(zhì)系數(shù)和如何去除魚肉中非氨基酸態(tài)氮的干擾進行研究，并探討可行的改進措施。

1 凱氏定氮法測定蛋白質(zhì)的原理

蛋白質(zhì)是含氮的有機化合物。食品與硫酸和硫酸銅、硫酸鉀一同加熱消化，使蛋白質(zhì)分解，分解的氨與硫酸結(jié)合生成硫酸銨。然后堿化蒸餾使氨游離，用硼酸吸收后，以硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定液滴定，根據(jù)酸消耗量乘以換算系數(shù)，即為蛋白質(zhì)含量。蛋白質(zhì)含量的計算公式如式(1)、(2)。

式中：w為試樣中蛋白質(zhì)的含量/(g/100g)；w1為試樣中氮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)/%；V1為試樣消耗硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定液的體積/mL；V2為試劑空白消耗硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定液的體積/mL；V3為試樣消化液的定容體積/mL；V4為堿化蒸餾的試樣消化液體積/mL；c為硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定液的濃度/(mol/L)；0.0140為1.0mL硫酸(c(1/2 H2SO4)=1mol/L)或鹽酸(c(HCl)=1mol/L)標(biāo)準(zhǔn)滴定液相當(dāng)?shù)牡馁|(zhì)量/g；m為試樣的質(zhì)量/g或體積/mL；F為氮換算為蛋白質(zhì)的系數(shù)：一般食物為6.25，乳制品為6.38，面粉為5.70，玉米、高粱為6.24，花生為5.46，米為5.95，大豆及其制品為5.71，肉與肉制品為6.25，大米、小米、燕麥、裸麥為5.83，芝麻、向日葵為5.30。F值計算方法見公式(3)和(4)[2]。

式中：N表示蛋白質(zhì)中總氮含量/%；F表示氮換算為蛋白質(zhì)的系數(shù)；C表示樣品中各氨基酸的百分含量/%；n表示氨基酸分子中所含氮原子數(shù)；W表示氨基酸的相對分子質(zhì)量；14表示氮原子的相對原子質(zhì)量；i取值1到18，表示計算蛋白質(zhì)氮含量所統(tǒng)計的18種氨基酸。

由式(2)可知，試樣蛋白質(zhì)含量測定值是否準(zhǔn)確只與兩個因素相關(guān)，即試樣氮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(w1)和氮換算蛋白質(zhì)的系數(shù)(F)。如要采用凱氏定氮法準(zhǔn)確測定試樣的真實蛋白質(zhì)含量，則必須已知正確的F值并測定得出試樣真實的蛋白質(zhì)的氮含量(排除非蛋白質(zhì)氮干擾)。目前國家標(biāo)準(zhǔn)和水產(chǎn)品行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的測定蛋白質(zhì)的方法(凱氏定氮法)中都沒有專門為魚類明確標(biāo)示氮換算蛋白質(zhì)的系數(shù)，研究人員和水產(chǎn)行業(yè)相關(guān)從業(yè)人員普遍采用肉與肉制品的換算系數(shù)(6.25)。為了改進測定魚及魚肉制品蛋白質(zhì)含量的凱氏定氮法，有必要針對蛋白質(zhì)換算系數(shù)和如何去除魚肉中非氨基酸態(tài)氮的干擾展開深入的探討。

2 凱氏定氮法在魚蛋白測定中遇到的問題分析

2.1 魚類氮換算蛋白質(zhì)的系數(shù)

基于文獻報道的40種魚類的肌肉氨基酸分析結(jié)果[3-36]，按照公式(3)計算得到了40種魚類的氨基酸態(tài)氮(aminoacid nitrogen，AN)含量，根據(jù)公式(4)推導(dǎo)出了40種魚類的F值(表1)。由表1可見，40種魚的F值均高于目前常采用的6.25，除淡水魚魴、羅非魚和瓣結(jié)魚F值在6.7左右，淡水石首魚F值為7.9外，絕大部分魚類的F值在7.0～7.5之間。

表1 40種常見經(jīng)濟魚類氨基酸含氮量及換算系數(shù)Table 1 Amino acid nitrogen and conversion factors in 40 species of commercial fish

表2 鯔魚不同部位和軍曹魚不同生長階段氨基酸態(tài)氮含量和換算系數(shù)比較Table 2 Comparisons on amino acid nitrogen and conversion factors in differentMugil cephalustissues and the growth period ofRachycent ron canadumLinnaeus

表3 魚類不同性別及生長方式氨基酸態(tài)氮含量和換算系數(shù)比較Table 3 Comparisons on amino acid nitrogen and conversion factor for different genders and growth styles of fish

表4 10種海水魚[25]肌肉和卵的氨基酸態(tài)氮含量和換算系數(shù)Table 4 Comparisons on amino acid nitrogen and conversion factor of muscle and egg in 10 species of marine fish

表2和表3統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，鯔魚不同部位、軍曹魚不同生長階段以及文昌魚不同性別對氨基酸態(tài)氮含量(AN)的影響很小，F(xiàn)值變異系數(shù)均小于1%；3種海水魚(黃顙魚、石斑魚、鯔魚)在不同生長方式(野生/飼養(yǎng))下氨基酸態(tài)氮含量的變異系數(shù)均小于1.5%。表4所示的絕大部分海水魚的肌肉和卵的氨基酸態(tài)氮含量的變異系數(shù)小于1.5%。由此可見，同一種屬魚類的不同性別、不同部位、不同組織、不同生長階段、不同生長方式以及肌肉與卵的氨基酸態(tài)氮含量的變異程度很小，F(xiàn)值非常接近。由此初步推斷，同一種屬魚類的F值相對固定，在凱氏定氮法測定魚類蛋白質(zhì)含量時，同種屬魚類采用相同氮換算蛋白質(zhì)的系數(shù)是可行的。

2.2 魚類非氨基酸態(tài)氮含量(NAN)分析

如上所述，非氨基酸態(tài)氮是凱氏定氮法測定魚蛋白質(zhì)的另一主要干擾因素。從表5和表6統(tǒng)計數(shù)據(jù)可見，魚類的非氨基酸態(tài)氮含量(NAN)差異巨大。30種不同種屬的魚類(海水魚類和淡水魚類)的非氨基酸態(tài)氮的含量差別在2%～30%，并且同一種屬魚類的非氨基酸態(tài)氮含量的變異性也很大(變異系數(shù)多在50%左右)。雖然統(tǒng)計樣本量有限，但是由表6可以看出，同一種屬魚類所處不同育成方式(野生/飼養(yǎng))其非氨基酸態(tài)氮含量也會產(chǎn)生明顯差別；鯔魚不同部位的非氨基酸態(tài)氮含量差別很大；雌雄文昌魚非氨基酸態(tài)氮含量也有差別。

表5 30種魚類非氨基酸態(tài)氮含量比較Table 5 Comparisons on non-amino acid nitrogen in 30 species of fish

表6 魚類不同性別、不同育成方式及不同部位的非氨基酸態(tài)氮含量比較Table 6 Comparison of non-amino acid nitrogen in different genders,growth styles and tissues of fish

鮮活魚類的非氨基酸態(tài)氮主要是肌肉內(nèi)的氧化三甲胺、尿素、嘌呤和嘧啶堿基、咪唑化合物、胍基化合物以及甜菜堿類化合物。魚死后貯藏過程中在微生物和酶的作用下還會分解蛋白質(zhì)，產(chǎn)生小分子的氨及胺類化合物使魚體的非氨基酸態(tài)氮含量升高，其生成量與魚體的腐敗程度有相關(guān)性[37]。由上述分析可得出一個結(jié)論：不同種屬魚類，或同種屬的魚類(海水魚類或者淡水魚類)，其非氨基酸態(tài)氮含量都存在巨大差異。特別是，魚類還會因為貯藏過程而導(dǎo)致魚體非氨基酸態(tài)氮的含量差異。魚類非氨基酸態(tài)氮含量的不確定性為魚肉蛋白質(zhì)含量測定帶來了一定的困難。如果要采用凱氏定氮法準(zhǔn)確測定魚肉蛋白質(zhì)含量，則首先要排除非氨基酸態(tài)氮的干擾。

3 改進措施的探討

鮮活魚類的非氨基酸態(tài)氮(氧化三甲胺、尿素、嘌呤和嘧啶堿基、咪唑化合物、胍基化合物以及甜菜堿類化合物)和魚死后貯藏過程中在微生物和酶的作用下產(chǎn)生的氨及胺類化合物具有揮發(fā)性，可采用揮發(fā)性鹽基氮的測定方法(GB/T 5009.44—2003《肉與肉制品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法》[38])由凱氏定氮裝置在堿性溶液中將這類堿性含氮物質(zhì)蒸餾出來，以硼酸溶液回收。回收的非氨基酸態(tài)氮含量采用凱氏定氮的方法測定，計算非氨基酸態(tài)氮的含量。

因此，可行的凱氏定氮法測定魚類蛋白質(zhì)含量的公式為：

式中：w為試樣中蛋白質(zhì)的含量/%；w1為試樣中總氮的含量/%；w2為試樣中非氨基酸態(tài)氮的含量/%；F為已知的某種魚類的氮換算蛋白質(zhì)的系數(shù)。

4 結(jié) 論

通過對30種魚類中非氨基酸態(tài)氮含量的分析，證實非氨基酸態(tài)氮是凱氏定氮法測定魚蛋白質(zhì)含量的主要干擾因素。通過對40種魚類氮換算蛋白質(zhì)的系數(shù)的統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)當(dāng)前所普遍采用的F值(6.25)與其真實F值(7.0～7.5)相差很大，這給氮換算魚蛋白質(zhì)含量時帶來了一定的誤差。本文還簡述了采用揮發(fā)性鹽基氮檢測方法測定魚肉中非氨基酸態(tài)氮的措施：在測定的總氮數(shù)值基礎(chǔ)上扣除其非氨基酸態(tài)氮含量，再以真實F值換算魚蛋白質(zhì)含量，測定結(jié)果將更加可靠。

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Interference Factors of Protein Determination in Fish using Kjeldahl Method

LU Jian-zhang，SUN Li-hua，ZHOU Yan-gang*
(Institute of Health Food, Zhejiang Academy of Medical Science, Hangzhou 310013, China)

TS254.7

A

1002-6630(2010)19-0453-04

2010-01-14

浙江省科技廳重大項目(2007F10031)

魯健章(1981—)，男，助理研究員，博士研究生，主要從事食品科學(xué)與工程研究。E-mail：lujianzhang@yahoo.cn

*通信作者：周彥鋼(1955—)，男，高級實驗師，主要從事保健食品研究與開發(fā)。E-mail：zyg195588@yahoo.cn