魏新元，聞盼盼，丑敏霞，樊明濤

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

重組牛乳鐵素融合蛋白的原核表達及其抑菌活性分析

魏新元1，聞盼盼1，丑敏霞2，樊明濤1

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

為建立生物合成牛乳鐵素的方法，根據(jù)牛乳鐵素氨基酸序列確定其編碼序列，利用PCR技術(shù)獲得基因擴增產(chǎn)物，接著將該產(chǎn)物與編碼魚腥藍細菌Anabaena sp. PCC 7120的DNA聚合酶基因dnaENI中斷裂的內(nèi)含肽基因Asp dnaEIn的PCR產(chǎn)物進行重組PCR，將獲得的重組融合基因再克隆到表達載體pET-28a構(gòu)建重組融合表達質(zhì)粒。結(jié)果顯示，融合表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌后經(jīng)誘導(dǎo)能在大腸桿菌表達宿主Escherichia.coli BL21(DE3) 中大量表達，且細胞裂解液與純化的Anabaena sp. PCC 7120中含斷裂內(nèi)含肽Asp DnaEIc的DNA聚合酶蛋白DnaECI混合反應(yīng)后對金黃色葡萄球菌具有抑制作用。

牛乳鐵素；重組P C R；融合基因；融合蛋白

牛乳鐵素是牛乳鐵蛋白的降解產(chǎn)物[1-2]，它由靠近牛乳鐵蛋白氨基端的2 5個氨基酸組成，序列為FKCRRWQWRMKKLGAPSITCVRRAF[3]。牛乳鐵素為一種新型抗微生物多肽，它能抑制多種細菌、病毒甚至寄生蟲等生長[4-7]。

目前，商用牛乳鐵素主要通過胃蛋白酶水解牛乳鐵蛋白獲得[8]，此法為當前藥用牛乳鐵素生產(chǎn)的最佳方法。但此法工藝復(fù)雜、成本高、回收率低。牛乳鐵素也可通過多肽合成儀進行合成，但此法價格昂貴，也不適于大量生產(chǎn)，僅限于研究用的小量制備。

采用基因工程體外合成牛乳鐵素具有廣闊的前景。傳統(tǒng)蛋白質(zhì)生物合成是將目的蛋白與特定標簽進行融合構(gòu)建，借助標簽對目的蛋白進行親和吸附純化[9]，該法成本低廉、工藝簡單、回收率高，是當前生物合成蛋白的常用方法。但該法需要進行酶解和再次分離，因此易導(dǎo)致目的蛋白產(chǎn)量、穩(wěn)定性和純度的降低[9]。

內(nèi)含肽的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用使蛋白質(zhì)的生物合成與純化得到了大大改進。該方法首先將目的蛋白與內(nèi)含肽及某一標簽進行融合構(gòu)建，利用標簽對融合蛋白進行分離純化后，再在內(nèi)含肽的自我剪接作用下，僅將目的蛋白剪切下來，從而使目的蛋白只需一步就能完成分離和純化[10]。鑒于此，本研究將牛乳鐵素編碼序列與魚腥藍細菌Anabaena sp. PCC 7120的DNA聚合酶DnaE中斷裂的內(nèi)含肽Asp dnaEIn在體外進行重組后，克隆到表達載體pET28a的His標簽前，構(gòu)建成三聯(lián)融合表達質(zhì)粒，然后利用大腸桿菌表達系統(tǒng)對牛乳鐵素融合蛋白進行超量表達并進行抑菌實驗，旨在為牛乳鐵素一步純化提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

魚腥藍細菌Anabaena sp. PCC 7120(在28～30℃，120r/min，40μE/m2s連續(xù)光照下培養(yǎng)，其DNA聚合酶DnaE由分離的兩個基因dnaENI和dnaECI編碼，并分別含斷裂的內(nèi)含肽Asp DnaEIn和Asp DnaEIc)、 Escherichia coli TG1大腸桿菌常規(guī)克隆宿主、E. coli BL21(DE3)大腸桿菌表達宿主，3種菌株均由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國家重點實驗室惠贈；金黃色葡萄球菌、志賀氏菌由本實驗室保存。

1.1.2 質(zhì)粒

pBluescript SK(-)常規(guī)克隆載體(含α-互補和氨芐青霉素抗性(Ampr)雙重篩選標記)、pET28a表達載體(含卡那霉素抗性(kanamycin，Kmr)篩選標記)，兩種質(zhì)粒均由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國家重點實驗室惠贈。

1.1.3 試劑

DnaECI蛋白(含內(nèi)含肽Asp DnaEIc的Anabaena sp.PCC 7120的dnaECI基因在E. coli BL21(DE3)中表達后被純化的蛋白[11])；PCR引物由西安沃爾森生物技術(shù)有限公司合成；限制性核酸內(nèi)切酶、高保真的DNA聚合酶Probest、T4DNA連接酶 大連TaKaRa公司；DNA回收試劑盒 北京百泰克生物技術(shù)有限公司；氯化鈣、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、甘氨酸等為進口或國產(chǎn)分析純或電泳純試劑。

1.2 方法

1.2.1 牛乳鐵素基因確定

根據(jù)已知的牛乳鐵素(LfcB)的氨基酸序列，然后依照中心法則，并結(jié)合各氨基酸密碼子在大腸桿菌中的使用效率確定牛乳鐵素的基因序列。

1.2.2 牛乳鐵素重組融合基因的構(gòu)建

分別通過PCR獲得牛乳鐵素和Anabaena sp. PCC 7120內(nèi)含肽基因dnaEIn的擴增產(chǎn)物，并使牛乳鐵素基因下游序列與dnaEIn上游序列的部分序列能互補配對。然后采用重組PCR，將兩個基因PCR產(chǎn)物進行重疊、延伸，從而獲得重組融合基因[12]。為了保證牛乳鐵素的翻譯起始，實驗設(shè)計中在其編碼序列上游加入翻譯起始密碼子；為了保證牛乳鐵素與內(nèi)含肽之間的分離，在其基因下游加入內(nèi)含肽剪接區(qū)上游5個氨基酸的編碼序列。

1.2.3 牛乳鐵素融合表達質(zhì)粒的構(gòu)建與誘導(dǎo)表達

將獲得的融合基因首先插入到常規(guī)克隆質(zhì)粒pBluescript SK(-)中，再將陽性質(zhì)粒中的外源基因克隆到表達載體pET28a的His-tag標簽前，從而獲得三聯(lián)融合表達質(zhì)粒。將融合表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達宿主E. coli BL21(DE3)[11,13]后，在37℃、180r/min條件下，以1mmol/L isopropyl β-D-thiogalactoside(IPTG)誘導(dǎo)牛乳鐵素融合蛋白的超量表達[14]。具體操作參考文獻[15]進行。

1.2.4 牛乳鐵素融合蛋白裂解與抑菌活性鑒定

內(nèi)含肽Asp DnaEIn和Asp DnaEIc分別為Anabaena sp. PCC 7120斷裂的DNA聚合酶DnaE所含內(nèi)含肽的氨基端和羧基端，斷裂的內(nèi)含肽只有在共同存在時才具有反式剪接或剪切作用[12]。牛乳鐵素融合蛋白經(jīng)誘導(dǎo)表達后，利用超聲波破碎誘導(dǎo)表達后的細胞，離心取上清液，然后在上清液中加入純化的DnaECI蛋白和終濃度為100mmol/L的dithiothreitol(DTT)[12]，20℃條件下反應(yīng)，然后取反應(yīng)液檢測其抑菌活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛乳鐵素基因序列的確定

已知牛乳鐵素由25個氨基酸FKCRRWQWRMKK LGAPSITCVRRAF組成[3]，由于本研究擬定在大腸桿菌中對其進行超量表達，因此需要依照中心法則，并考慮各氨基酸密碼子使用效率來確定牛乳鐵素的編碼序列。已經(jīng)證實Anabaena sp. PCC 7120的DNA聚合酶dnaE基因能在E. coli BL21(DE3)中高效表達[12]，因此以該基因作為參考，利用Bioedit軟件，分析在dnaE中存在的牛乳鐵素各氨基酸密碼子的出現(xiàn)頻率(數(shù)據(jù)未提供)，選取頻率高者組成牛乳鐵素的編碼序列，序列為：5′-TTCAAGTGTC GCCGCTGGCA GTGGCGTATG AAAAAGCTGG GTGCCCCGTC CATCACGTGT GTGCGTCGTG CCTTC-3′。

2.2 重組融合基因的構(gòu)建

圖1 PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳Fig.1 Agarose gel electrophoresis of the PCR products separately containing LfcB, dnaEIn and LfcB-dnaEIn

2.3 融合基因表達質(zhì)粒的構(gòu)建

將獲得的融合基因LfcB-dnaEIn以限制性內(nèi)切酶Spe I和Xho I消化后純化回收，接著與經(jīng)過相同的內(nèi)切酶消化的載體質(zhì)粒pBluescript SK(-)使用T4DNA連接酶，在16℃條件下進行連接，然后將酶連產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌TG1，利用Amp抗性并結(jié)合藍白斑篩選標記進行篩選，獲得的陽性克隆進行SpeI和XhoI雙酶切鑒定，結(jié)果如圖2A所示。泳道3和4對應(yīng)陽性重組質(zhì)粒，其雙酶切兩條片段分別與PCR產(chǎn)物和pBluescript SK(-)空質(zhì)粒的酶切片段大小一致。接著對泳道3的克隆子進行測序驗證，結(jié)果顯示，相對于設(shè)計序列，插入序列中有一個堿基發(fā)生了置換，但不改變氨基酸序列(數(shù)據(jù)未提供)，因此證實為正確的重組質(zhì)粒，命名為pSK-N。

接著將pSK-N利用內(nèi)切酶Nco I和EcoR I進行消化，純化回收的外源基因LfcB-dnaEIn連接到表達載體pET28a的Nco I和EcoR I位點之間，以卡那霉素作為抗性篩選標記，獲得陽性克隆。對陽性克隆質(zhì)粒進行NcoI和XhoI雙酶切鑒定，結(jié)果如圖2B所示。其雙酶切兩條片段分別與PCR產(chǎn)物和空載體pET28a的酶切片段大小一致，命名為pET28-N。

圖2 重組質(zhì)粒pSK-N和pET28-N限制性內(nèi)切酶消化后電泳Fig.2 Agarose gel electrophoresis of recombinant plasmids pSK-N(panel A) and pET28-N (panel B) digested by the restriction endonucleases SpeI and XhoI

2.4 融合表達質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達

將融合表達質(zhì)粒pET28-N轉(zhuǎn)化表達宿主E. coli BL21(DE3)(該菌株中IPTG可以誘導(dǎo)T7RNA聚合酶的大量表達)，然后挑取部分單菌落轉(zhuǎn)接于液體LB培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，并以終濃度為1mmol/L 的IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)3h[14]，接著，細胞裂解物經(jīng)過SDS-PAGE，檢測牛乳鐵素融合蛋白的表達情況，結(jié)果如圖3所示。外源融合蛋白在E. coli BL21(DE3)中被誘導(dǎo)大量表達，其分子質(zhì)量與理論值16.9ku相符。結(jié)果還說明，牛乳鐵素融合蛋白對E. coli BL21(DE3)未造成明顯毒害作用。

圖3 大腸桿菌中表達的重組融合蛋白SDS-PAGEFig.3 SDS-PAGE analysis of the recombinant fusion protein expressed in E. coli BL21(DE3)

2.5 牛乳鐵素融合蛋白抑菌活性分析

收集經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)牛乳鐵素表達的E. coli細胞，用PBS緩沖液(含0.02mol/L Na2HPO4- NaH2PO4，0.5mol/L NaCl，pH7.6)洗滌細胞兩次，再以PBS緩沖液進行重懸。然后利用超聲波破碎儀裂解細胞，裂解液經(jīng)12000r/min離心20min后取上清，等量分裝成小份。接著，取3小份，向上清液中加入已經(jīng)純化的凍存的DnaECI蛋白溶液和終濃度為100mmol/L的DTT[12]，20℃分別反應(yīng)0.5、1、2h，然后取等體積反應(yīng)物加入涂布金黃色葡萄球菌平板的LB培養(yǎng)基中的圓孔中，37℃條件下培養(yǎng)18h，檢測各反應(yīng)產(chǎn)物對金黃色葡萄球菌生長的抑制作用，結(jié)果如圖4所示?？?、4、5中反應(yīng)產(chǎn)物對金黃色葡萄球菌具有明顯的抑制作用。但是反應(yīng)產(chǎn)物對志賀氏菌沒有表現(xiàn)抑菌活性。

圖4 牛乳鐵素融合蛋白被誘導(dǎo)表達的細胞裂解液與DnaECI反應(yīng)后對金黃色葡萄球菌的抑制效果Fig.4 Antibacterial effect of DnaECI-mediated reaction products containing bovine lactoferrici fusion protein on Staphylococcus aureus

3 討 論

盡管牛乳鐵素對多種細菌包括大腸桿菌都具有抑菌作用[4-5]，但是牛乳鐵素編碼序列與內(nèi)含肽基因進行基因融合后克隆到表達載體中獲得的重組融合表達質(zhì)粒，在IPTG的誘導(dǎo)下可以在大腸桿菌中成功表達，說明表達的融合蛋白消除或消弱了牛乳鐵素對宿主細胞的明顯傷害。而被誘導(dǎo)表達細胞的裂解液與DnaECI蛋白混合后表現(xiàn)出對金黃色葡萄球菌的抑制作用，說明斷裂的兩個內(nèi)含肽Asp DnaEIn和Asp DnaEIc之間發(fā)生了剪接或剪切作用，導(dǎo)致了內(nèi)含肽的解離，使牛乳鐵素分離出來，從而表現(xiàn)出抑菌活性。

PCR技術(shù)能使目的基因得到大量擴增，而重組PCR技術(shù)則可以利用兩個或多個分離的基因之間人為引入的互補配對序列將它們拼接起來，形成融合基因。本實驗首先通過重組PCR獲得了牛乳鐵素基因的PCR產(chǎn)物，然后將其與加入一段牛乳鐵素編碼序列的Anabaena sp.PCC 7120的DnaE內(nèi)含肽基因的PCR擴增產(chǎn)物進一步進行重組PCR，獲得重組牛乳鐵素融合基因。最終測序結(jié)果說明構(gòu)建是成功的，這表明重組PCR技術(shù)對不同來源的兩個基因進行融合構(gòu)建是切實可行的。由于長片段基因的PCR擴增往往保真度不高，因此該技術(shù)為長基因的擴增提供了思路，可以通過將長基因進行分段擴增，最后利用重組PCR進行拼接獲得完整基因。該技術(shù)也可用于多個基因的融合構(gòu)建，這為構(gòu)建多酶體系的發(fā)酵工程菌提供了一定的理論和技術(shù)基礎(chǔ)。

由于在牛乳鐵素氨基端含有甲硫氨酸，而在其羧基端帶有內(nèi)含肽Asp DnaEIn剪接區(qū)上游宿主蛋白中的5個固有氨基酸，是否表達牛乳鐵素融合蛋白后的細胞裂解液與DnaECI的反應(yīng)產(chǎn)物沒有對志賀氏菌表現(xiàn)出抑菌活性與此相關(guān)，有待進一步研究。

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Prokaryotic Expression and Antibiotic Activity of Recombinant Bovine Lactoferricin Fusion Protein

WEI Xin-yuan1，WEN Pan-pan1，CHOU Min-xia2， FAN Ming-tao1
(1. College of Food Science and Engineering, Northwest A & F University, Yangling 712100, China；2. College of Life Sciences, Northwest A & F University, Yangling 712100, China)

In order to establish a bovine lactoferricin biosynthesis method, the bovine lactoferricin-encoding gene was determined on the basis of amino acid sequence. A recombinant fusion gene was obtained by means of overlapping PCR following the purification of the separate PCR products of the bovine lactoferricin-encoding sequence and the split intein Asp dnaEIn gene from the DNA polymerase gene dnaENI of Anabaena sp. PCC 7120, and the obtained fusion gene was subsequently cloned into the expression plasmid pET-28a to construct a recombinant fusion expression plasmid. The results showed that recombinant fusion proteins were over-expressed after the expression host Escherichia coli BL21 (DE3) containing the recombinant bovine lactoferricin fusion expression plasmid was induced and that reaction products of over-expressed recombinant bovine lactoferricin lysates and the purified Anabaena sp. PCC 7120 DnaECI, which contained split intein Asp DnaEIc, could inhibit Staphylococcus aureus.

bovine lactoferricin；overlapping PCR；fusion gene；fusion protein

Q784

A

1002-6630(2010)19-0295-04

2010-03-28

高等學(xué)校博士點科研基金項目(20090204120028)；陜西省自然科學(xué)基金項目(SJ08B12)

魏新元(1971—)，男，講師，博士，主要從事食品微生物學(xué)與生物技術(shù)研究。 E-mail: wheixinyuan@126.com