杜 軍,李憶軍
(湖南省津市市人民醫(yī)院藥劑科,湖南津市 415400)
拉莫三嗪(1amotrigine,LTG)為一種新型的廣譜抗癲癇藥,對部分性發(fā)作、GTCS、Lennox-Gastaut綜合征、失神發(fā)作和肌陣攣發(fā)作有效,臨床上用于難治性癲癇的輔助治療[1-3]。由于其半衰期較長(24~30 h),可以每日1次給藥。苯巴比妥(phenobarbital,PBT)常作為小兒癲癇的首選藥物,廣譜,起效快,對GTCS療效好,也用于單純及復(fù)雜部分性發(fā)作,對發(fā)熱驚厥有預(yù)防作用[4-5],半衰期長達37~399 h。上述藥物的治療范圍窄,且抗癲癇效果、藥物不良反應(yīng)與藥動學(xué)特征有關(guān)。為了評價療效或確定給藥方案,使給藥方案個體化,以提高藥物治療水平,達到臨床安全、有效、合理的用藥。因此開展治療藥物監(jiān)測有重要臨床意義。本研究在文獻[2-6]的基礎(chǔ)上進行改進,采用以氯硝西泮(Clonazepam,CNZ)為內(nèi)標,建立了HPLC法同時測定兩者的濃度,為臨床合理用藥提供依據(jù)。
Agilent高效液相色譜分析儀(美國Agilent公司);低溫高速離心機(德國Beckman公司);KQ50B型超聲波清洗器(江蘇昆山市超聲儀器有限公司);XW-80A漩渦混和器(上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠);電子分析天平(AG285型,瑞士梅特勒-托利多公司)。
LTG對照品(批號:051130,葛蘭素史克制藥有限公司,純度:99.5%);苯巴比妥對照品(批號:171222-200504,中國藥品生物制品檢定所);內(nèi)標氯硝西泮(批號:150230-200201,中國藥品生物制品檢定所);乙腈、甲醇、二氯甲烷均為進口色譜純(美國Tedia公司);磷酸鉀緩沖液(PBS,北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司,分析純);異丙醇(國藥集團化學(xué)試劑有限公司,分析純);水為去離子水。
色譜柱:AgilentZorbaxXDB-Cl8柱(150mm×4.6mm,5μm)色譜柱;流動相:0.1%乙酸-乙腈;梯度程序為:0.00→7.00 min,A∶B=90∶10;7.00→12.00 min,A∶B=70∶30;12.00→14.00 min,A∶B=90∶10。流速:1.0 ml/min;檢測波長:240 nm;柱溫:40℃;內(nèi)標:氯硝西泮;結(jié)果表明,LTG、PBT和CNZ的保留時間分別約為6.2、10.8和12.7 min,各成分峰形良好,分離完全。色譜圖見圖1。
精密稱取 LTG、PBT 和 CNZ 10.0、10.0和 5.00 mg,分別置于25 ml量瓶中,加甲醇溶液溶解并定容配制成400.0,400.0和 200.0 μg/ml的貯備液。
清晨患者服藥前抽取靜脈血2 ml,室溫3500 r/min離心8 min,分離并留取血清,置-20℃冰箱保存,待測。
冰箱中取出血清,室溫解凍,吸取血清200 μl,置5 ml的離心管中,加入CNZ貯備液 10 μl、乙酸乙酯1 ml,渦旋混合60 s,3500 r/min離心10 min,吸取乙酸乙酯,于40℃用氮氣吹干,加入甲醇溶液100 μl溶解,精密吸取取20 μl進樣。
2.5.1 標準血樣 精密量取“2.2”項下貯備液適量,用甲醇溶液稀釋,加入適量空白人血清,制成含 LTGl.0~50.0 μg/ml、PBT 1.0~150.0 μg/ml的系列濃度標準血樣。
2.5.2 線性試驗 取 “2.5.1” 項下含 LTG分別為1.00、2.00、5.00、10.00、20.00、50.00 μg/ml,含 PBT 分別為 1.0、2.0、5.0、10.0、50.0、150.0 μg/ml的標準血樣,按“2.4”項下方法處理,進樣測定,分別以樣品與內(nèi)標的峰面積比Y對濃度C線性回歸,得 LTG 標準曲線為:Y=0.1739C-0.0221(r=0.9991);PBT標準曲線為Y=0.2105C+0.0337(r=0.9990)。表明血清中 LTG 在 1.00~50.00 μg/ml和 PBT 在 1.0~150.0 μg/ml的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。
取人空白血清200 μl,分別加入LTG和PBT對照品工作液,配成濃度為 2.00、20.00和 40.00 μg/ml和濃度為 5.0、20.0和50.0μg/ml的標準血清。按“2.4”項下方法操作,分別測得兩藥物的回收率及日內(nèi)、間精密度,結(jié)果見表1。LTG及PBT的平均回收率均>97.0%,日內(nèi)精密度<4.3%,日間精密度<5.4%。
在此色譜條件下,苯妥英鈉和卡馬西平的保留時間分別為15.1 min和21.3 min,對兩種藥物峰及內(nèi)標峰均無干擾。用本法監(jiān)測的56例樣品中,亦未見有其他峰干擾。
本法用于數(shù)例患者服藥達穩(wěn)態(tài)后(門診患者兩藥均服用1個月后),血清中藥物谷濃度(清晨抽取服藥前患者空腹血)的測定,患者血清色譜圖見圖2。
表1 拉莫三嗪、苯巴比妥回收率和日內(nèi)、日間精密度及回收率Tab.1 Recovery,precisions of intra-day and inter-day of lamotrigine and phenobarbital
LTG是一聯(lián)苯三嗪衍生物,為抗癲癇新藥,通過作用于鈉離子通道,抑制興奮型神經(jīng)遞質(zhì)的釋放,從而達到藥理活性[7],近年來已成為血藥濃度檢測的目標藥物。PBT是苯巴比妥(Phenobarbital,PBT)為嘧啶類衍生物,為 GABAA受體激動劑,作用于巴比妥酸位點而增加Cl-的傳導(dǎo)[8]。癲癇的治療一般主張單藥治療,但對于難治性癲癇往往采用聯(lián)合用藥作用于不同靶點而發(fā)揮療效[9]。常用的抗癲癇藥物由于其治療指數(shù)小,個體差異大往往需監(jiān)測合并使用的抗癲癇藥的血藥濃度。文獻[3]有對上述兩種藥物含量同時測定的報道,但對測量儀器的配制要求較高,一般醫(yī)療單位不具備條件。本研究采用梯度洗脫法對化學(xué)結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)差別較大的成分進行較理想分離并對其含量測定。
文獻[3]報道LTG在214 nm波長處吸收最大,可提高LTG測定的靈敏度,但本法采用了240 nm的波長,目的是為了兼顧PBT的含量測定,減少基線的飄移和雜質(zhì)峰的影響,完全滿足臨床上檢測的需要。
文獻[6]報道LTG的含量測定中采用氟西泮作為內(nèi)標物,PBT的含量測定[7-9]采用艾司唑侖為內(nèi)標物。本實驗曾嘗試用到該兩種化合物作內(nèi)標,但在該色譜條件下與目標峰分離效果不理想,后選用氯硝西泮,考慮到三者具有較理想的分離度,且峰位又不與其他抗癲癇藥物及內(nèi)源性物質(zhì)重疊,故本研究選擇氯硝西泮作為兩藥物含量同時測定的內(nèi)標物。
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