陳克杰，周景文，劉立明，劉杰，堵國成，陳堅

1 江南大學 食品科學與技術國家重點實驗室，無錫 214122

2 江南大學 工業(yè)生物技術教育部重點實驗室，無錫 214122

3 江蘇江山制藥有限公司，靖江 214500

工業(yè)生物技術

高滲條件下利用蔗糖提升2-酮基-L-古龍酸生產(chǎn)效率

陳克杰1,2，周景文1,2，劉立明1,2，劉杰3，堵國成2，陳堅1,2

1 江南大學 食品科學與技術國家重點實驗室，無錫 214122

2 江南大學 工業(yè)生物技術教育部重點實驗室，無錫 214122

3 江蘇江山制藥有限公司，靖江 214500

旨在進一步提升維生素C前體2-酮基-L-古龍酸 (2-KLG) 的生產(chǎn)效率。在詳細考察了2-KLG工業(yè)化生產(chǎn)過程中滲透壓變化規(guī)律的基礎上，研究了高滲對混合菌系細胞生長和2-KLG合成的影響，提出蔗糖促進伴生菌巨大芽胞桿菌Bacillusmegaterium生長，進而促進普通生酮古龍酸菌Ketogulonigenium vulgare生長和產(chǎn)酸的策略。結(jié)果表明，2-KLG的積累和堿性物質(zhì)的流加使?jié)B透壓上升了832 mOsmol/kg；高滲抑制了巨大芽胞桿菌的生長 (15.4%)，從而抑制普通生酮古龍酸菌 (31.7%) 的生長，導致2-KLG產(chǎn)量和生產(chǎn)強度分別下降67.5%和69.3% (以1 250 mOsmol/kg為例)；蔗糖的添加則顯著促進巨大芽胞桿菌的生長，使高滲條件下 (搖瓶，1 250 mOsmol/kg) 2-KLG產(chǎn)量 (40.6 g/L) 提高87%；在3 L發(fā)酵罐中，補加10 mmol/L蔗糖使2-KLG發(fā)酵周期縮短10.8%，2-KLG生產(chǎn)強度提高10.4%。研究成果為在環(huán)境脅迫下提高混菌生產(chǎn)目標代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量提供了潛在的策略。

混菌發(fā)酵，2-酮基-L-古龍酸，碳源調(diào)節(jié)，維生素C，高滲

Abstract:This study aimed to further enhance 2-keto-L-gulonic acid (2-KLG) production efficiency. A strategy for enhancingKetogulonigenium vulgaregrowth and 2-KLG production by improvingB. megateriumgrowth with sucrose was developed based on the time course of osmolality during 2-KLG industrial scale fermentation and effects of osmolality on cells growth and 2-KLG production.Results showed that the accumulation of 2-KLG and the feeding of alkaline matter led to an osmolality rise of 832 mOsmol/kg in the culture broth. High osmotic stress (1 250 mOsmol/kg) made the growth ofB. megateriumandK. vulgaredecreased 15.4% and 31.7%, respectively, and consequently the titer and productivity of 2-KLG reduced 67.5% and 69.3%, respectively. When supplement sucrose under high osmotic condition (1 250 mOsmol/kg),B. megateriumgrowth was significantly improved, with the result that2-KLG production was increased 87%. Furthermore, by applying this sucrose addition strategy further to batch fermentation in 3 L fermentor, the productivity of 2-KLG increased 10.4%, and the duration of fermentation declined 10.8%. The results presented here provide a potential strategy for enhancing the target metabolites produced by mixed strains at environmental stress.

Keywords:mixed culture, 2-keto-L-gulonic acid, carbon source regulation, Vitamin C, hyperosmotic stress

維生素C工業(yè)化生產(chǎn)普遍采用“二步發(fā)酵”工藝，即L-山梨糖到維生素C前體—2-酮基-L-古龍酸(2-keto-L-gulonic acid，2-KLG) 的轉(zhuǎn)化由普通生酮古龍酸菌 (Ketogulonigenium vulgare，俗稱小菌，原來鑒定為Gluconobacter oxydans) 和巨大芽胞桿菌(Bacillusmegaterium，俗稱大菌) 組成的混合菌系來完成[1]。而在典型2-KLG生產(chǎn)的速率模型中，L-山梨糖濃度與產(chǎn)酸速率為擬零級動力學關系，表明2-KLG合成速率與發(fā)酵液中底物濃度無關，而與菌體濃度成正比[2]。因此，2-KLG的生產(chǎn)通常采用發(fā)酵液中L-山梨糖濃度處于最適范圍，通過補料分批發(fā)酵的模式，以維持較高的2-KLG合成速率[3]。類似于有機酸發(fā)酵，2-KLG發(fā)酵過程中需流加一定的NaOH或Na2CO3等堿性物質(zhì)以維持發(fā)酵液中pH處于合適的生理范圍內(nèi)。而隨著發(fā)酵體系中2-KLG和Na+濃度的持續(xù)增加，導致滲透壓也持續(xù)上升，進而影響菌體生長、細胞形態(tài)、膜流動性、代謝流分配和目標代謝產(chǎn)物的合成[4-6]。因此，如能在充分理解2-KLG發(fā)酵過程中滲透壓的變化規(guī)律及其對混合菌系生理代謝功能影響的基礎上，發(fā)展高效合理的調(diào)控策略，有望進一步提高2-KLG生產(chǎn)效率。

本文在研究了2-KLG工業(yè)化生產(chǎn)過程中滲透壓的變化規(guī)律和高滲條件下混合菌系代謝行為 (菌體生長和2-KLG合成) 的基礎上，針對性地提出碳源調(diào)節(jié)策略，實現(xiàn)了促進巨大芽胞桿菌生長，增加活性物質(zhì)分泌，增強混菌耐高滲能力，提升2-KLG生產(chǎn)效率的目的。這一研究結(jié)果為在混菌發(fā)酵體系中調(diào)控滲透壓等環(huán)境因素促進目標代謝產(chǎn)物的高效合成提供了研究思路。

1 材料與方法

1.1 菌種

普通生酮古龍酸菌 (K. vulgare，俗稱小菌)，巨大芽胞桿菌 (B. megaterium，俗稱大菌)，由江蘇江山制藥有限公司 (江蘇靖江) 提供。

1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基 (g/L)：L-山梨糖20，酵母膏3，牛肉膏3，大豆蛋白胨10，玉米漿1.5，尿素1，KH2PO41，MgSO42，CaCO31。

基礎發(fā)酵培養(yǎng)基 (g/L)：L-山梨糖80，玉米漿5，尿素 12，KH2PO41，MgSO41，CaCO35。

用氯化鈉作為滲透誘導劑時，根據(jù)需要適量添加。蔗糖補加濃度為10 mmol/L。以上所有培養(yǎng)基用自來水配置，由2 mol/L NaOH調(diào)pH值為6.7～7.0。碳源 (L-山梨糖) 和氮源分開滅菌，滅菌條件為121℃，15 min。

1.3 培養(yǎng)方法

1.3.1搖瓶培養(yǎng)

種子培養(yǎng)：先按劃線法自然搭配巨大芽胞桿菌、普通生酮古龍酸菌，再從混菌斜面接種子培養(yǎng)基(75 mL/750 mL搖瓶)，30℃、200 r/min培養(yǎng)18 h。

發(fā)酵培養(yǎng)：將種液按接種量10%接入發(fā)酵培養(yǎng)基 (75 mL/750 mL 搖瓶)，30℃、200 r/min培養(yǎng) 72 h左右。定期取樣檢測相關參數(shù)。

1.3.2發(fā)酵罐培養(yǎng)

在3 L發(fā)酵罐 (韓國BioTron公司) 中進行。發(fā)酵罐初始裝液量為2 L，接種量為10%。整個發(fā)酵過程中，通氣 (1:0.8～1) 下，溶氧控制在30%～50%；溫度控制在 (30±0.5)℃；接種后調(diào)pH 7.0，前期不控制 pH，產(chǎn)酸后 pH下降，自動流加 30% NaOH使 pH維持在 6.9～7.0；定期取樣檢測 2-KLG和 L-山梨糖的含量。當殘?zhí)菨舛冉档?.3%以下時，發(fā)酵結(jié)束。

1.4 分析方法

1.4.1菌體濃度測定

菌體濃度測定參見文獻[7]。

1.4.2巨大芽胞桿菌和普通生酮古龍酸菌的計數(shù)

巨大芽胞桿菌和普通生酮古龍酸菌以結(jié)晶紫染色后，用血球計數(shù)板在顯微鏡下計數(shù)。

1.4.3滲透壓測定

用冰點滲透壓計 (德國Gonotec公司) 測定。

1.4.42-KLG與L-山梨糖含量的測定

采用Agilent 1200高效液相色譜儀測定[8]。色譜柱：Aminex HPX-87H (Bio-Rad)；流動相：0.005 mol/L H2SO4；流速：0.6 mL/min；柱溫：35℃；進樣量：5 μL；檢測器：示差折光檢測器。

1.4.5L-山梨糖到2-KLG轉(zhuǎn)化率的計算[9]

2 結(jié)果

2.1 2-KLG積累是發(fā)酵體系中滲透壓提升的主因

2-KLG工業(yè)化生產(chǎn)中相關發(fā)酵參數(shù)的變化趨勢如圖1A所示。典型的2-KLG發(fā)酵過程中，初始L-山梨糖濃度為15～25 g/L，發(fā)酵4～8 h后通過流加維持發(fā)酵過程中L-山梨糖濃度為15～30 g/L，36～44 h停止流加，直至發(fā)酵結(jié)束。發(fā)酵終點時滲透壓與起始點比較，上升了832 mOsmol/kg。結(jié)合前述，發(fā)酵過程中滲透壓的增加并非源于 L-山梨糖濃度的增加，因其濃度始終維持在一定范圍，且發(fā)酵終點時濃度有所降低。2-KLG的不斷分泌導致發(fā)酵體系pH不斷下降，為了將維持pH在一定的生理范圍內(nèi)需不斷流加NaOH，使得2-KLG的鈉鹽濃度不斷增加，從而導致滲透壓不斷上升。進一步分析發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵液中2-KLG濃度與滲透壓值的增加呈良好的線性關系(圖 1B)。這一結(jié)果表明，導致發(fā)酵液中滲透壓升高的主要原因在于2-KLG的不斷積累。

2.2 高滲對2-KLG發(fā)酵的影響

不同滲透壓 (氯化鈉誘導) 對混合菌系生長和2-KLG合成的影響如圖2所示。當滲透壓為1 250 mOsmol/kg時，穩(wěn)定期OD660值為4.51，與對照組 (不加NaCl) 比較，下降了14.9%。相應地，2-KLG 產(chǎn)量 (21.6 g/L) 和生產(chǎn)強度(0.3 g/(L·h)) 均比對照組下降了67.5%和 69.3%。繼續(xù)提高發(fā)酵液中的滲透壓，細胞生長和2-KLG合成則進一步受到抑制，如滲透壓大于1 400 mOsmol/kg時，2-KLG產(chǎn)量僅為10.3 g/L。

作者采用顯微計數(shù)法進一步研究了高滲 (以1 250 mOsmol/kg為例) 對混合菌系生長的影響，結(jié)果如圖3所示。與對照組比較：1)巨大芽胞桿菌的延遲期延長了9 h，普通生酮古龍酸菌延長了11 h；2)巨大芽胞桿菌對數(shù)期平均比生長速率下降了27.7%，普通生酮古龍酸菌下降了 52.9%；3) 巨大芽胞桿菌穩(wěn)定期菌體數(shù)量下降了 15.4%，普通生酮古龍酸菌下降了 31.7%。上述結(jié)果表明，高滲顯著抑制了普通生酮古龍酸菌的生長。然而，普通生酮古龍酸菌生長和合成2-KLG的能力取決于混合菌系中巨大芽胞桿菌的生長狀況[10]。因此，高滲抑制普通生酮古龍酸菌生長和2-KLG合成的根本原因在于巨大芽胞桿菌生長受到抑制，導致活性物質(zhì)分泌減少。鑒于此，高滲條件下如何調(diào)控巨大芽胞桿菌的生長，對2-KLG的高效生產(chǎn)就顯得尤為重要。

圖1 典型2-KLG工業(yè)發(fā)酵過程曲線 (A) 及滲透壓與2-KLG含量的關系 (B)Fig.1 Time-course of 2-KLG fermentation process during industrial production (A) and the correlation between osmolality and the 2-KLG concentration (B).

圖2 滲透壓對混菌生長和2-KLG生產(chǎn)的影響Fig.2 Effect of osmolality on the mixed strains growth and the 2-KLG production.

2.3 蔗糖促進高滲條件下2-KLG生產(chǎn)

在2-KLG發(fā)酵體系中，巨大芽胞桿菌并不能利用L-山梨糖、僅能利用玉米漿中的碳源生長。玉米漿中還原糖的濃度約為11%[11]，因此作者選取并研究了玉米漿中典型碳源對高滲條件下 (以 1 250 mOsmol/kg為例) 混合菌系生長和2-KLG合成的影響，結(jié)果如表1所示。表1表明，碳源的添加有效地促進了混合菌系生長和2-KLG合成。但總體而言，二糖更能顯著提高2-KLG的合成效率。

圖3 高滲對混菌中巨大芽胞桿菌 (A) 和普通生酮古龍酸菌 (B) 生長的影響Fig.3 Effect of osmolality on the growth ofB. megaterium(A) andK. vulgare(B).

表1 高滲條件下不同碳源對2-KLG生產(chǎn)和混菌生長的影響Table 1 Effect of different carbon sources on the 2-KLG production and the mixed strains growth under 1 250 mOsmol/kg condition

基于上述結(jié)果，作者進一步研究了高滲條件(以1 250 mOsmol/kg為例) 下添加蔗糖對混菌生長和2-KLG合成的影響 (圖4)。與未添加蔗糖的對照組 (1 250 mOsmol/kg) 比較，平穩(wěn)期 (48 h) 混菌濃度、72 h時2-KLG含量 (40.6 g/L)、2-KLG生產(chǎn)強度、L-山梨糖消耗速率分別提高了73%、87%、95.0%和 88.9%。同時，蔗糖的添加也明顯地提高了2-KLG對L-山梨糖的轉(zhuǎn)化率。

圖4 蔗糖促進高滲條件下2-KLG的生產(chǎn)Fig.4 Sucrose enhances the 2-KLG production under hyperosmotic stress (1 250 mOsmol/kg) induced by NaCl.

2.4 蔗糖提升分批發(fā)酵2-KLG生產(chǎn)效率

作者在3 L發(fā)酵罐中進一步研究了添加10 mmol/L蔗糖對2-KLG生產(chǎn)的影響 (圖5和表2)。與未添加的對照組比較：1) 巨大芽胞桿菌穩(wěn)定期細胞提高42%，普通生酮古龍酸菌穩(wěn)定期細胞提高10.6%；2) 發(fā)酵周期由 37 h縮至 33 h，發(fā)酵時間縮短了10.8%；3) 轉(zhuǎn)化率由 89.9%提高到 92.8%；4)2-KLG 生產(chǎn)強度由 1.87 g/(L·h)提高到 2.07 g/(L·h)，提高了10.4%。

圖5 蔗糖補加對2-KLG混菌分批發(fā)酵的影響Fig.5 Effect of sucrose on the 2-KLG fermentation by mixed culture in 3 L fermentator. (A) 1, 2: 2-KLG; 3, 4: sorbose.

表2 3 L發(fā)酵罐上蔗糖對2-KLG發(fā)酵參數(shù)的影響Table 2 Effect of sucrose on the 2-KLG fermentation parameters by mixed culture in 3 L fermentator

3 討論

作為一個典型的有機酸發(fā)酵過程，維生素C前體物質(zhì)2-KLG發(fā)酵體系中pH因2-KLG的積累而不斷下降，為了維持最適pH范圍需不斷流加的堿性物質(zhì)則導致滲透壓不斷升高 (圖 1)。不斷升高的滲透壓顯著抑制了巨大芽胞桿菌和普通生酮古龍酸菌的生長，并最終限制了2-KLG的合成 (圖3)。高滲對混合菌系中普通生酮古龍酸菌的毒害作用表現(xiàn)為：1) 滲透壓對普通生酮古龍酸菌的“直接作用”：直接抑制普通生酮古龍酸菌生長和產(chǎn)酸；2) 滲透壓對伴生菌巨大芽胞桿菌的“間接作用”：影響巨大芽胞桿菌生長以及活性物質(zhì)的分泌，從而間接影響普通生酮古龍酸菌生長和產(chǎn)酸。2-KLG發(fā)酵中普通生酮古龍酸菌與巨大芽胞桿菌之間的關系體現(xiàn)在：1)普通生酮古龍酸菌具有高效合成2-KLG的全部酶系，但單獨培養(yǎng)時生長非常微弱，且?guī)缀蹼y以合成2-KLG；2)巨大芽胞桿菌不具備合成 2-KLG的酶系，但能分泌活性物質(zhì)促進普通生酮古龍酸菌生長和合成 2-KLG；3) 普通生酮古龍酸菌生長和合成2-KLG的能力隨著發(fā)酵初期混合菌系中巨大芽胞桿菌比例的增加而增加；4) 巨大芽胞桿菌裂解釋放的胞內(nèi)活性物質(zhì)對普通生酮古龍酸菌細胞生長和L-山梨糖脫氫酶活性具有強烈的促進作用[12-13]，且發(fā)酵體系中活性物質(zhì)的豐度直接決定普通生酮古龍酸菌合成2-KLG的效率?；诖?，如何在高滲條件下提高2-KLG合成效率的著眼點在于保證巨大芽胞桿菌的充分生長，以提供高豐度的生物活性物質(zhì)?；旌暇抵芯薮笱堪麠U菌僅能利用玉米漿中的碳源。因此，培養(yǎng)體系中充足的碳源對巨大芽胞桿菌的生長就顯得尤為重要。作者在分析玉米漿中碳源種類及其對巨大芽胞桿菌和普通生酮古龍酸菌生長影響的基礎上，發(fā)現(xiàn)高滲 (1 250 mOsmol/kg) 條件下蔗糖顯著促進巨大芽胞桿菌單獨生長與混菌體系中普通生酮古龍酸菌的生長和產(chǎn)酸，且效果一致。在 3 L發(fā)酵罐分批發(fā)酵中添加蔗糖使2-KLG的生產(chǎn)強度提高了 10.4%。這一研究結(jié)果表明，添加蔗糖能夠有效提高高滲條件下巨大芽胞桿菌的生長能力，促使生物活性物質(zhì)的分泌，進而促進普通生酮古龍酸菌的生長和2-KLG的合成。

REFERENCES

[1] Yin GL, Tao ZX, Yu LH,et al. Studies on the production of vitamin C precursor—2-keto-L-gulonic acid from L-sorbose by fermentation Ⅰ. Isolation, screening and identification of 2-keto-L-gulonic acid producing bacteria.Acta Microbiol Sin, 1980, 20(3): 246–251.

尹光琳, 陶增鑫, 于龍華, 等. L-山梨糖發(fā)酵產(chǎn)生維生素C前體—2-酮基-L-古龍酸的研究 I. 菌種的分離篩選和鑒定. 微生物學報, 1980, 20(3): 246–251.

[2] Wei DZ, Yuan WK, Yin GL,et al.Studies on kinetic model of vitamin C two-step fermentation proces. Chin J Biotech, 1992,8(3): 277–282.

魏東芝, 袁渭康, 尹光琳, 等. 維生素 C二步發(fā)酵過程動力學模型的研究. 生物工程學報, 1992, 8(3):277–282.

[3] Ren SX, He JM, Song Q,et al.Production of vitamin C precursor—2-keto-L-gulonic acid from L-sorbose by a novel bacterial component system of SCB329-SCB933 II.High sorbose fermentation by installment-batch method.Ind Microbiol, 1997,27(2): 5–9.

任雙喜, 何建明, 宋祺, 等. 新組合菌系 SCB329-SCB933利用L-山梨糖發(fā)酵生產(chǎn)維生素C前體—2-酮基-L-古龍酸的研究 II. 利用 L-山梨糖批加技術實現(xiàn)高糖發(fā)酵. 工業(yè)微生物, 1997, 27(2): 5–9.

[4] Pianetti A, Battistelli M, Citterio B,et al. Morphological changes ofAeromonas hydrophilain response to osmotic stress.Micron, 2009, 40(4): 426–433.

[5] Laroche C, Beney L, Marechal PA,et al. The effect of osmotic pressure on the membrane fluidity ofSaccharomyces cerevisiaeat different physiological temperatures.Appl Microbiol Biotechnol, 2001, 56(1/2):249–254.

[6] Varela C, Agosin E, Baez M,et al. Metabolic flux redistribution inCorynebacterium glutamicumin response to osmotic stress.Appl Microbiol Biotechnol, 2003, 60(5):547–555.

[7] Xu A, Yao JM, Yu ZL. Improvement of mingle strains in the fermentation of 2-keto-L-gulonic acid—Precursor of Vc by ion implantation (I) screening of strain IPPM-1028 for high-yielding 2-keto-L-gulonic acid.Ind Microbiol,1998, 28(4): 23–26.

許安, 姚建銘, 余增亮. 離子注入改良維生素 C二步發(fā)酵混合菌研究(I) 2-酮基-L-古龍酸高產(chǎn)菌系 IPPM-1028的選育. 工業(yè)微生物, 1998, 28(4): 23–26.

[8] Urbance JW, Bratina BJ, Stoddard SF,et al. Taxonomiccharacterization ofKetogulonigenium vulgaregen. nov.,sp. nov andKetogulonigenium robustumsp. nov., which oxidize L-sorbose to 2-keto-L-gulonic acid.Int J Syst Evol Microbiol, 2001, 51(3): 1059–1070.

[9] Zhu KL, Zhang HH, Sun CB,et al. Studies on inoculation in the two-step-fermentation of vitamin C.J Microbiol,1998, 18(2): 13–15.

朱可麗, 張海宏, 孫傳寶, 等. 維生素 C二步發(fā)酵混菌接種控制. 微生物學雜志, 1998, 18(2): 13–15.

[10] Feng S, Sun CB, Zhang ZZ,et al. Effects ofBacillus megateriumon growth and 2KGA synthesizing ofGluconobacteroxydansin vitamin C two-step fermentation process.J Microbiol, 1998, 18(1): 6–9.

馮樹, 孫傳寶, 張忠澤, 等. 維生素 C二步發(fā)酵中巨大芽孢桿菌對氧化葡萄糖酸桿菌生長和產(chǎn)酸的影響. 微生物學雜志, 1998, 18(1): 6–9.

[11] Ligget RW, Koffler H. Corn steep liquor in microbiology.Bacteriol Rev, 1948, 12(4): 297–311.

[12] Feng S, Zhang Z, Zhang CG,et al. Effect ofBacillus megateriumonGluconobacter oxydansin mixed culture.Chin J Appl Ecol, 2000, 11(1): 120–123.

馮樹, 張舟, 張成剛, 等. 混合培養(yǎng)中巨大芽孢桿菌對氧化葡萄糖酸桿菌的作用. 應用生態(tài)學報, 2000, 11(1):120–123.

[13] Zhao, SG, Yao LM, Su CX,et al. Purification and properties of a new L-sorbose dehydrogenase accelerative protein fromBacillus megateriumbred by ion-beam implantation.Plasma Sci Technol, 2008, 10(3): 398–402.

Enhancing 2-keto-L-gulonic acid production under hyperosmotic stress by adding sucrose

Kejie Chen1,2, Jingwen Zhou1,2, Liming Liu1,2, Jie Liu3, Guocheng Du2, and Jian Chen1,2

1State Key Laboratory of Food Science and Technology,Jiangnan University,Wuxi214122,China
2Key Laboratory of Industrial Biotechnology,Ministry of Education,Jiangnan University,Wuxi214122,China
3Jiangsu Jiangshan Pharmaceutical Co.Ltd.,Jingjiang214500,China

Received:April 16, 2010;Accepted:July 19, 2010

Supported by:National High Technology Research and Development Program of China (863 Program) (No. 2006AA020303), Key Projects in the National Science and Technology Pillar Program during the Eleventh Five-Year Plan Period (No. 2007BAI46B02), National Basic Research Program of China(973 Program) (No. 2007CB714306), Key Program of National Natural Science Foundation of China (No. 20836003).

Corresponding author:Liming Liu. Tel: +86-510-85918307; E-mail: mingll@jiangnan.edu.cn

Jian Chen. E-mail: jchen@jiangnan.edu.cn

國家高技術研究發(fā)展計劃 (863計劃) (No. 2006AA020303)，“十一五”國家科技支撐計劃 (No. 2007BAI46B02)，國家重點基礎研究發(fā)展計劃(973計劃) (No. 2007CB714306)，國家自然科學基金重點項目 (No. 20836003) 資助。