邢海新，黃永東，李巖，羅堅(jiān)，張麗葉，馬光輝，蘇志國(guó)

1 北京化工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 100029

2 中國(guó)科學(xué)院過程工程研究所 生化工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100190

3 中國(guó)科學(xué)院過程工程研究所 國(guó)家生化工程技術(shù)研究中心，北京 100190

生物技術(shù)與方法

親和介質(zhì)及溶液條件對(duì)蛋白質(zhì)溶液中內(nèi)毒素去除的影響

邢海新1,2，黃永東2,3，李巖2，羅堅(jiān)2，張麗葉1，馬光輝2，蘇志國(guó)2

1 北京化工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 100029

2 中國(guó)科學(xué)院過程工程研究所 生化工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100190

3 中國(guó)科學(xué)院過程工程研究所 國(guó)家生化工程技術(shù)研究中心，北京 100190

生物制品中內(nèi)毒素的去除是一項(xiàng)十分重要的工作。為了更好地去除各種生物制品中的內(nèi)毒素，采用合成的多粘菌素B瓊脂糖親和介質(zhì)，通過靜態(tài)吸附的方法去除蛋白質(zhì)溶液中的內(nèi)毒素。重點(diǎn)考察了介質(zhì)的間臂長(zhǎng)度、配基密度以及各種溶液條件 (pH值、鹽種類和濃度、蛋白質(zhì)種類和濃度、內(nèi)毒素濃度、添加劑等) 對(duì)內(nèi)毒素去除率及蛋白質(zhì)回收率的影響。分別采用動(dòng)態(tài)濁度法和Lowry法檢測(cè)內(nèi)毒素含量和蛋白質(zhì)濃度。結(jié)果表明該介質(zhì)具有載量高、去除速度快、去除率高、可重復(fù)使用的特點(diǎn)。此外，配基密度、pH值、鹽濃度和蛋白質(zhì)特性 (等電點(diǎn)和疏水性) 對(duì)內(nèi)毒素去除效果均有重要影響。在優(yōu)化的條件下，血紅蛋白、人血清白蛋白和溶菌酶的回收率分別達(dá)到87.2%、73.4%和97.3%，相應(yīng)的內(nèi)毒素去除率分別達(dá)到99.8%、97.9%和99.7%。闡明了各種因素對(duì)內(nèi)毒素去除率和蛋白質(zhì)回收率的影響規(guī)律，為生物制品中內(nèi)毒素的高效去除提供了參考。

多粘菌素B，親和介質(zhì)，內(nèi)毒素，溶液條件，去除率，回收率

Abstract:Endotoxin removal is essential for the safety of biological products. To remove endotoxin efficiently, we used polymyxin B (PMB) affinity adsorbent to remove endotoxin from protein solutions by static adsorption. We studied the effects of spacer length and ligand density of the affinity adsorbent, pH, salt type and concentration, protein type and concentration, endotoxin concentration,and additive on endotoxin removal and protein recovery. Endotoxin content and protein concentration were determined by test and Lowry assay respectively. The results showed that PMB affinity adsorbent had high capacity, high adsorption speed, high removal efficiency and good reusability. In addition, ligand density, pH, salt concentration and the isoelectric point and hydrophobicity of protein all had remarkable influence on the endotoxin removal. Under the optimal conditions, the recoveries of hemoglobin, human serum albumin and lysozyme were 87.2%, 73.4% and 97.3%, respectively, and the corresponding endotoxin removal rates 99.8%,97.9% and 99.7%, respectively. This study illustrated the effects of solution conditions on the efficiency of endotoxin removal and protein recovery, and would provide useful reference for the efficient removal of endotoxin from biological products.

Keywords:polymyxin B, affinity adsorbent, endotoxin, solution conditions, removal efficiency, recovery

熱原 (Pyrogen) 泛指能引起哺乳類動(dòng)物發(fā)燒反應(yīng)的物質(zhì)，種類很多，其中最主要的是內(nèi)毒素 (Endotoxin)。內(nèi)毒素是一種脂多糖 (Lipopolysaccharide，LPS)，是革蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁外壁層上特有的結(jié)構(gòu)，細(xì)菌死亡或分解后被釋放出來。在生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)中，革蘭氏陰性菌被廣泛地應(yīng)用于生物制品 (如多肽和蛋白質(zhì)) 的生產(chǎn)，這些產(chǎn)品中經(jīng)常會(huì)含有大量的內(nèi)毒素。此外，即使起始樣品本身不含內(nèi)毒素，也可能由于環(huán)境或操作過程而受到熱原污染。內(nèi)毒素對(duì)生物體 (包括人體) 有著不可忽視的危害。少量的內(nèi)毒素 (2 ng/kg體重) 靜脈注射就可以引起發(fā)燒、腹瀉等反應(yīng)，大劑量時(shí)可引起血液循環(huán)障礙和內(nèi)毒素休克[1]。各國(guó)對(duì)生物制品的內(nèi)毒素含量都有嚴(yán)格的要求，一般規(guī)定每劑注射用針劑的內(nèi)毒素含量必須低于5 EU/kg體重[2-3]。因此，生物制品中內(nèi)毒素的去除一直是一項(xiàng)十分重要的工作。

內(nèi)毒素主要由類脂A (lipid A)、核心寡糖 (core oligosaccharide) 和 O-特異性多糖 (O-specific polysaccharide，O-antigen) 三部分組成[4]。內(nèi)層 (類脂 A) 和中層 (核心寡糖) 含有大量的磷酸基和羧基，因此內(nèi)毒素的等電點(diǎn)較低 (約3.1)，在通常pH條件下帶負(fù)電荷。內(nèi)毒素的特異性多糖區(qū)是親水的，而類脂A區(qū)是疏水的，結(jié)構(gòu)上類似表面活性劑。內(nèi)毒素具有化學(xué)異源性，不同來源的內(nèi)毒素的分子量從幾千到幾萬不等，且內(nèi)毒素的兩親性使其易在水溶液中形成分子量高達(dá) 40萬至 100萬不等的聚集體、膠束或膠囊[4]。正是由于內(nèi)毒素的性質(zhì)極不均一，人們很難找到一種簡(jiǎn)單或通用的去除方法。更令人頭疼的是，帶負(fù)電荷的內(nèi)毒素還可以和帶正電荷的堿性蛋白結(jié)合，也可以通過二價(jià)陽離子 (如Ca2+等) 的橋接作用和酸性蛋白形成復(fù)合體，類脂A的疏水特性也可導(dǎo)致內(nèi)毒素和疏水性蛋白結(jié)合，給熱原的去除和目標(biāo)蛋白的回收工作帶來嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。迄今為止，相分離[5-6]、超濾[7-8]、凝膠過濾[9-10]、離子交換[10-12]、疏水層析[10,13-14]都已用于蛋白質(zhì)溶液中內(nèi)毒素的去除，但上述方法通常存在選擇性差、內(nèi)毒素去除率低和目標(biāo)蛋白回收率低等問題。

親和層析具有高度的選擇性，是去除內(nèi)毒素的一種較為理想的方法。自20世紀(jì)80年代起，組胺、組氨酸、脫氧膽酸、聚陽離子 (聚L-賴氨酸，PLL；聚乙基亞胺，PEI)、多粘菌素B (PMB) 等[15-16]就被用作配基制備親和介質(zhì)用于從牛血清白蛋白、溶菌酶、質(zhì)粒DNA中去除內(nèi)毒素[17-18]。其中PMB用于內(nèi)毒素的去除已引起廣泛的關(guān)注。Issekutz等[19]采用溴化氰活化法制備 PMB親和介質(zhì)用于水溶液中內(nèi)毒素的去除，可以達(dá)到99%以上的去除率；鄒漢法等[20]用PMB柱層析去除水溶液中內(nèi)毒素，去除率達(dá)到90%以上。與水溶液中內(nèi)毒素的去除相比，蛋白質(zhì)溶液中內(nèi)毒素的去除更加復(fù)雜，不僅內(nèi)毒素去除率出現(xiàn)不同程度的下降，而且存在嚴(yán)重的蛋白質(zhì)損失 (20%～50%) 現(xiàn)象[17-18,21-22]。在內(nèi)毒素去除過程中，蛋白質(zhì)回收率的高低不僅與蛋白質(zhì)的性質(zhì)有關(guān)，還與介質(zhì)性質(zhì)及溶液環(huán)境有關(guān)，而以往的研究[17-18,21-22]只探索了PMB親和介質(zhì)用于蛋白質(zhì)溶液中內(nèi)毒素去除的可行性，并未對(duì)上述各因素及其影響規(guī)律進(jìn)行系統(tǒng)的考察。此外，內(nèi)毒素和許多蛋白質(zhì)之間存在明顯的相互作用[5,7,23-24]，加大了內(nèi)毒素去除的難度。

要掌握蛋白質(zhì)溶液中內(nèi)毒素的去除規(guī)律，必須進(jìn)行介質(zhì)、蛋白質(zhì)、溶液環(huán)境等多種因素之間相互作用的系統(tǒng)研究，為此本實(shí)驗(yàn)首先合成了不同間臂長(zhǎng)度和配基密度的PMB親和介質(zhì)，并選取對(duì)內(nèi)毒素去除具有重要影響的4個(gè)關(guān)鍵因素 (介質(zhì)種類、pH值、NaCl濃度及蛋白質(zhì)種類) 進(jìn)行四因素四水平的正交實(shí)驗(yàn)。在此基礎(chǔ)上，針對(duì)不同蛋白質(zhì)體系進(jìn)行pH值、NaCl濃度等主要影響因素的考察，闡明各個(gè)因素的影響規(guī)律。此外，還考察了對(duì)內(nèi)毒素去除具有一定影響的其他操作條件 (如溫度、時(shí)間及初始內(nèi)毒素濃度等)。通過系統(tǒng)的研究，從中發(fā)現(xiàn)了一些規(guī)律。在優(yōu)化的條件下，采用多粘菌素B親和介質(zhì)可以實(shí)現(xiàn)不同蛋白質(zhì)體系 (血紅蛋白、人血清白蛋白和溶菌酶) 中內(nèi)毒素的高效去除和目標(biāo)蛋白質(zhì)的高效回收，為生物制品中內(nèi)毒素的高效去除研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑材料與儀器

內(nèi)毒素L4524 (Sigma)；內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品 (中國(guó)藥品生物制品檢定所)；鱟試劑 (廣東湛江安度斯生物有限公司)；血紅蛋白 Hb (Sigma)；人血清白蛋白HSA (Sigma)；溶菌酶LYS (Sigma)；多粘菌素B硫酸鹽 (Sigma)；瓊脂糖凝膠QZT 4FF (國(guó)家生化工程技術(shù)研究中心，北京)；其他試劑均為分析純。

垂直混合儀SB3 (BarloworldScientific，英國(guó))；離心機(jī)PMC-880 (TOMY KOGYO，日本)；真空泵SHZ-D (河南省鞏義市英嶺生化儀器廠)；搖床HZS-H (哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司)。

所有玻璃器皿洗凈后210℃下干熱滅菌3 h。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1親和介質(zhì)制備

瓊脂糖凝膠經(jīng)不同的環(huán)氧活化試劑 (環(huán)氧氯丙烷和 1,4-丁二醇二縮水甘油醚) 活化后，直接偶聯(lián)PMB親和配基，得到去除內(nèi)毒素的PMB QZT FF親和介質(zhì)。

1.2.2內(nèi)毒素儲(chǔ)備液配制

準(zhǔn)確稱取內(nèi)毒素 (L4524) 1 mg，用1 mL無熱原注射用水溶解，配制成1 mg/mL (4 177 700 EU/mL)的內(nèi)毒素儲(chǔ)備液，使用時(shí)用相應(yīng)的緩沖液稀釋至目標(biāo)濃度。

1.2.3蛋白儲(chǔ)備液配制

血紅蛋白儲(chǔ)備液：準(zhǔn)確稱取 100 mg血紅蛋白(Hb)，用 20 mL無熱原注射用水溶解，配制成5 mg/mL的蛋白質(zhì)儲(chǔ)備液，使用時(shí)用相應(yīng)的緩沖液稀釋至目標(biāo)濃度。

人血清白蛋白儲(chǔ)備液和溶菌酶儲(chǔ)備液配制方法同上。

1.2.4內(nèi)毒素吸附

在 GMP車間中采用靜態(tài)吸附法進(jìn)行內(nèi)毒素吸附實(shí)驗(yàn)。取出保存于20%乙醇中的PMB QZT FF親和介質(zhì)，放置于G3砂芯漏斗中，分別用無熱原注射用水、20 mmol/L PB (含1% (W/V) 脫氧膽酸鈉，pH 7.0)、無熱原注射用水充分淋洗，用真空泵抽干，去除親和介質(zhì)中的內(nèi)毒素。準(zhǔn)確稱取100 mg親和介質(zhì)，轉(zhuǎn)移至5 mL西林瓶中，加入2 mL相應(yīng)樣品(2 mL內(nèi)毒素溶液、或2 mL蛋白質(zhì)溶液、或2 mL內(nèi)毒素和蛋白質(zhì)的混合溶液)，密封后放入搖床中，120 r/min、相應(yīng)溫度下吸附相應(yīng)時(shí)間，然后離心取上清測(cè)定其內(nèi)毒素含量和蛋白質(zhì)濃度。使用過的介質(zhì)分別用無熱原注射用水、20 mmol/L PB (含1%脫氧膽酸鈉，pH 7.0)、無熱原注射用水充分淋洗，抽干備用或保存于20%乙醇中。

在正交實(shí)驗(yàn)中，考察的各因素各水平分別為：1) 介質(zhì)種類：3C-M (間隔臂為3C中等配基密度)、10C-M (間隔臂為10C中等配基密度)、10C-L (間隔臂為 10C低配基密度)、10C-H (間隔臂為 10C高配基密度)；2) pH值：5 (20 mmol/L HAC-NaAC)、7 (20 mmol/L PB)、8 (20 mmol/L PB)、9 (20 mmol/L Tris-HCl)；3) NaCl濃度：0、0.15、0.5、1.0 mol/L；4) 蛋白質(zhì)種類：不含蛋白質(zhì)、血紅蛋白 (0.518 mg/mL)、人血清白蛋白 (0.464 mg/mL)、溶菌酶 (0.738 mg/mL)。樣品中 LPS濃度為 779.18 EU/mL，吸附溫度為4℃，時(shí)間為0.5 h。

在正交實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，又分別考察了 pH值(5～9)、NaCl濃度 (0～1.0 mol/L)、CaCl2濃度(0～0.2 mol/L) 對(duì)不同體系中內(nèi)毒素去除及蛋白質(zhì)回收的影響。

實(shí)驗(yàn)還考察了其他操作條件例如溫度 (4℃、25℃、37℃)、時(shí)間 (2 min～24 h)、初始內(nèi)毒素濃度 (8.3554～41 777.0 EU/mL)、蛋白質(zhì)濃度 (0～2.0 mg/mL)、添加劑 (EDTA、Triton X-100、脫氧膽酸鈉、SDS及尿素)、介質(zhì)使用次數(shù)對(duì)內(nèi)毒素去除的影響。

1.3 分析方法

1.3.1內(nèi)毒素檢測(cè)

動(dòng)態(tài)濁度法：參照《中國(guó)藥典2005年版第三部》附錄中Ⅺ E中的動(dòng)態(tài)濁度法[25]。

內(nèi)毒素去除率=(吸附前樣品中內(nèi)毒素的量?吸附后樣品中內(nèi)毒素的量)/吸附前樣品中內(nèi)毒素的量×100%。

1.3.2蛋白濃度檢測(cè)

Lowry法：參照《中國(guó)藥典2005年版第三部》附錄中Ⅵ B中的Lowry法[25]。

蛋白回收率=(吸附前樣品中蛋白的量?吸附后樣品中蛋白的量)/吸附前樣品中蛋白的量×100%。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同間隔臂長(zhǎng)度和配基密度親和介質(zhì)的制備

在親和介質(zhì)制備過程中，通過采用不同的環(huán)氧活化試劑和控制親和配基的加入量，得到不同間隔臂長(zhǎng)度 (3C和10C) 和配基密度 (2.5、5.0和7.5 mg/mL，L、M和H) 的PMB親和介質(zhì) (表1)。

表1 親和介質(zhì)的性能參數(shù)Table 1 Parameters of affinity adsorbent

2.2 正交實(shí)驗(yàn)

首先通過四因素四水平的正交實(shí)驗(yàn)考察了 4個(gè)關(guān)鍵因素 (介質(zhì)種類、pH值、NaCl濃度和蛋白質(zhì)種類) 對(duì)內(nèi)毒素去除率和蛋白質(zhì)回收率的影響，結(jié)果如表2和圖1所示。

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Orthogonal experiment results

圖1 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖Fig.1 Orthogonal experiment results. (A) Endotoxin removal efficiency. (B) Protein recovery. Medium 1: 3C-M, 2: 10C-M, 3:10C-L, 4: 10C-H; Protein 1: no protein, 2: Hb, 3: HSA, 4: LYS.

從蛋白質(zhì)回收率指標(biāo)來看，介質(zhì)種類和 NaCl濃度影響極其顯著，pH值的影響次之，蛋白質(zhì)種類的影響最?。粡膬?nèi)毒素去除率指標(biāo)來看，4個(gè)因素的影響基本相當(dāng)，但影響程度不如對(duì)蛋白質(zhì)回收率的影響顯著。綜合考慮蛋白質(zhì)回收率和內(nèi)毒素去除率，10C-M介質(zhì) (3#，10C間臂，中等配基密度) 最適合用于蛋白質(zhì)溶液中內(nèi)毒素的去除。隨著pH的升高，內(nèi)毒素去除率和蛋白質(zhì)回收率均呈現(xiàn)先升后降的變化趨勢(shì)，在 pH 7～8的條件下效果最好。隨著NaCl濃度的升高，蛋白質(zhì)回收率呈現(xiàn)先升后降的變化趨勢(shì)，但內(nèi)毒素去除率呈現(xiàn)先升后降然后再上升的復(fù)雜變化趨勢(shì)。從蛋白質(zhì)回收率的數(shù)據(jù)可以看出，堿性、弱疏水性蛋白 (LYS) 最有利于蛋白質(zhì)的回收，中性、強(qiáng)疏水性蛋白 (Hb) 次之，而酸性、中等疏水性蛋白 (HSA) 的損失最大，回收率最低。此外，HSA和LYS的加入導(dǎo)致內(nèi)毒素去除率出現(xiàn)明顯下降，而Hb的加入對(duì)內(nèi)毒素去除無明顯影響。

2.3 溶液環(huán)境對(duì)不同體系中內(nèi)毒素去除的影響

通過正交實(shí)驗(yàn)，篩選出了適合蛋白質(zhì)溶液中內(nèi)毒素去除的親和介質(zhì) (10C-M介質(zhì))，初步揭示了pH值和 NaCl濃度對(duì)內(nèi)毒素去除率和蛋白質(zhì)回收率的影響趨勢(shì)，但其具體的影響規(guī)律和作用機(jī)理還有待于通過單因素條件考察實(shí)驗(yàn)來闡明。此外，如何調(diào)節(jié)溶液環(huán)境來抑制不同蛋白質(zhì)在親和介質(zhì)上的非特異性吸附，在確保內(nèi)毒素高效去除的前提下進(jìn)一步提高蛋白質(zhì)的回收率還有待于解決。因此，有必要通過單因素實(shí)驗(yàn)繼續(xù)考察溶液環(huán)境 (pH值、NaCl濃度、二價(jià)陽離子Ca2+等) 對(duì)不同蛋白體系中內(nèi)毒素的去除和蛋白質(zhì)回收的影響規(guī)律。鑒于 10C-M介質(zhì)性能最佳，在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中均選用該介質(zhì)。實(shí)驗(yàn)首先對(duì)水溶液和Hb溶液中內(nèi)毒素的去除進(jìn)行了考察。

2.3.1pH值的影響

分別考察了不同 pH值 (5～9) 對(duì)不同體系 (水溶液和Hb溶液) 中內(nèi)毒素去除的影響 (LPS濃度為835.54 EU/mL，Hb濃度為0.51785 mg/mL，緩沖體系分別為20 mmol/L HAC-NaAC (pH 5.0)、20 mmol/L PB (pH 6.0)、20 mmol/L PB (pH 7.0)、20 mmol/L PB(pH 8.0) 和20 mmol/L Tris-HCl (pH 9.0)，吸附溫度為4℃，吸附時(shí)間為0.5 h)，同時(shí)進(jìn)行了單一的Hb體系的實(shí)驗(yàn) (不添加內(nèi)毒素)，以便考察親和介質(zhì)對(duì)Hb的非特異性吸附，結(jié)果如圖2所示。

對(duì)于單一的LPS體系，當(dāng)pH值從5.0增加到8.0時(shí)，內(nèi)毒素去除率從 98.12%逐步升高到99.97%，對(duì)應(yīng)內(nèi)毒素殘留量從15.72 EU/mL降低至0.22 EU/mL；當(dāng)pH值進(jìn)一步增加到9.0時(shí)，內(nèi)毒素去除率有所下降 (99.78%)，對(duì)應(yīng)內(nèi)毒素濃度有所升高(1.80 EU/mL)。上述變化趨勢(shì)與文獻(xiàn)報(bào)道的相似[20]，但去除率有了進(jìn)一步提高。文獻(xiàn)中報(bào)道用10 mg的親和介質(zhì)對(duì)應(yīng)吸附16 EU的內(nèi)毒素，去除率為92%[20]，本研究用100 mg的親和介質(zhì)對(duì)應(yīng)吸附1671.08 EU的內(nèi)毒素，在pH 6～9的范圍內(nèi)，內(nèi)毒素去除率均能達(dá)到99.69%以上，對(duì)應(yīng)濃度均能降至 2.62 EU/mL以下。內(nèi)毒素和親和配基PMB之間的作用主要是疏水作用和靜電作用。在低 pH值 (如 5.0) 條件下，內(nèi)毒素分子中的磷酸基和羧基離子化程度較小，可能導(dǎo)致內(nèi)毒素與 PMB配基之間的靜電作用強(qiáng)度降低。此外，pH的變化還可能影響內(nèi)毒素和PMB配基的分子結(jié)構(gòu)，并影響它們之間的疏水作用。對(duì)于含Hb的內(nèi)毒素體系，其去除率略低于不含Hb的體系，但其變化趨勢(shì)與不含 Hb的體系正好相反，說明Hb的存在對(duì)內(nèi)毒素的去除具有明顯的影響。

對(duì)于含內(nèi)毒素的Hb體系 (圖2 b)，在所考察的pH范圍內(nèi)，Hb均有不同程度的損失。隨著pH值從5.0逐步升高到 9.0，Hb的回收率先逐步增加后降低，在pH 7.0時(shí)達(dá)到極值68.05%。上述變化趨勢(shì)與單一的Hb體系基本相似。Hb的等電點(diǎn)約為7.2，親和配基PMB是一種等電點(diǎn)約在8～9之間的弱堿性物質(zhì)[26]，所以在pH 5～7、8和9時(shí)，二者之間的靜電作用力依次為同種正電荷靜電相斥、異種電荷靜電相吸和同種負(fù)電荷靜電相斥。但Hb回收率的變化趨勢(shì)卻與之相反，表明除了靜電作用，還有疏水等相互作用影響Hb和親和介質(zhì)間的相互作用。綜合考慮內(nèi)毒素的去除率和蛋白質(zhì)回收率，中性條件(pH 7.0) 最有利于Hb溶液中內(nèi)毒素的去除。

2.3.2NaCl濃度的影響

分別考察了不同NaCl濃度 (0～1.0 mol/L) 對(duì)不同體系 (水溶液和 Hb溶液) 中內(nèi)毒素去除的影響 (LPS濃度為 835.54 EU/mL，Hb濃度為0.51785 mg/mL，緩沖體系為 20 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，吸附溫度為4℃，吸附時(shí)間為0.5 h)，同時(shí)進(jìn)行了單一 Hb體系的實(shí)驗(yàn) (不添加內(nèi)毒素)，以便考察親和介質(zhì)對(duì)Hb的非特異性吸附，結(jié)果如圖3所示。

圖2 pH值對(duì)內(nèi)毒素去除的影響Fig.2 Effect of pH on endotoxin removal. (A) Aqueous solution. (B) Hb solution.

圖3 NaCl濃度對(duì)內(nèi)毒素去除的影響Fig.3 Effect of NaCl concentration on endotoxin removal. (A) Aqueous solution. (B) Hb solution.

對(duì)于單一的LPS體系，當(dāng)NaCl濃度從0逐步增加到0.15 mol/L時(shí)，內(nèi)毒素去除率從99.91%逐步降低到96.38%，相應(yīng)內(nèi)毒素濃度從0.22 EU/mL升高至 38.26 EU/mL；當(dāng) NaCl濃度繼續(xù)增加到1.0 mol/L時(shí)，內(nèi)毒素去除率又逐漸升高到99.55%，對(duì)應(yīng)的內(nèi)毒素濃度也降低至3.75 EU/mL。總之，低鹽濃度 (0 mol/L) 和較高的鹽濃度 (0.5～1.0 mol/L)有利于內(nèi)毒素的去除。內(nèi)毒素和親和配基PMB之間的作用主要是疏水作用和靜電作用，而鹽濃度 (離子強(qiáng)度) 的變化將導(dǎo)致疏水作用和靜電作用同時(shí)發(fā)生變化，但其變化趨勢(shì)是相反的 (增加鹽濃度有利于增強(qiáng)疏水作用，但會(huì)削弱靜電作用)，二者的協(xié)同作用導(dǎo)致了上述變化趨勢(shì)的出現(xiàn)。對(duì)于含Hb的內(nèi)毒素體系，變化趨勢(shì)與不含Hb的內(nèi)毒素相似，內(nèi)毒素去除率也基本相同。

對(duì)于單一的Hb體系，在所考察的NaCl濃度范圍內(nèi)，Hb均有不同程度的損失。隨著NaCl濃度從0逐步升高到1.0 mol/L，Hb的回收率逐步增加，變化趨勢(shì)與含內(nèi)毒素的Hb體系相似。在pH 8.0條件下，Hb和親和配基PMB之間存在靜電相互作用，導(dǎo)致部分 Hb吸附到介質(zhì)上，引起蛋白的損失。隨著 NaCl濃度的增加，二者之間的靜電作用減弱，吸附量減少，回收率增加。理論上，疏水性蛋白 Hb和親和配基PMB之間也存在疏水相互作用，但在所考察的NaCl濃度范圍內(nèi)，疏水作用較弱，以靜電作用為主。

2.3.3CaCl2濃度的影響

鑒于內(nèi)毒素之間、內(nèi)毒素和蛋白質(zhì)之間可能通過二價(jià)陽離子的橋接作用形成復(fù)合物，進(jìn)而影響內(nèi)毒素的去除和蛋白質(zhì)的回收，分別考察了不同CaCl2濃度 (0～0.2 mol/L) 對(duì)不同體系 (水溶液和Hb溶液) 中內(nèi)毒素去除的影響 (LPS濃度為417.77 EU/mL，緩沖體系為20 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，吸附溫度為4℃，吸附時(shí)間為4 h)，結(jié)果如圖4所示。

對(duì)于單一的LPS體系，當(dāng)CaCl2濃度從0增加到 0.02 mol/L時(shí)，內(nèi)毒素去除率從 99.96%降低到94.86%，對(duì)應(yīng)內(nèi)毒素含量從 0.15 EU/mL升高至21.49 EU/mL；當(dāng)CaCl2濃度從0.02 mol/L繼續(xù)增加到0.2 mol/L時(shí)，內(nèi)毒素去除率從94.86%又逐漸升高到99.95%，內(nèi)毒素含量也逐漸降低至0.21 EU/mL以下。與NaCl相比，CaCl2的影響機(jī)理更為復(fù)雜。CaCl2濃度的變化除了通過影響溶液的離子強(qiáng)度來改變內(nèi)毒素和親和配基 PMB之間的疏水作用和靜電作用外，還可通過二價(jià)陽離子 Ca2+的橋接作用促使內(nèi)毒素分子形成聚集體，影響內(nèi)毒素和親和介質(zhì)間的相互作用。上述三者的協(xié)同作用導(dǎo)致如圖 4所示的變化趨勢(shì)。

對(duì)于含Hb的內(nèi)毒素體系，其去除率的變化趨勢(shì)與不含Hb的內(nèi)毒素相似，但去除率略有降低，說明Hb的加入對(duì)內(nèi)毒素的去除產(chǎn)生了一定的負(fù)面影響，原因可能是 Ca2+的橋接作用促使部分內(nèi)毒素和 Hb形成復(fù)合物，不利于內(nèi)毒素的去除。在相同的離子強(qiáng)度下，內(nèi)毒素的去除率與NaCl體系 (圖3) 相似(除 CaCl2濃度為 0.02 mol/L)。

圖4 CaCl2濃度對(duì)內(nèi)毒素去除的影響Fig.4 Effect of CaCl2concentration on endotoxin removal. (A) Aqueous solution. (B) Hb solution.

對(duì)于Hb體系 (包括含和不含內(nèi)毒素2種體系)，在所考察的CaCl2濃度范圍內(nèi)，Hb均有不同程度的損失。CaCl2對(duì)Hb回收率的影響規(guī)律與NaCl的影響規(guī)律相似，唯一不同的是當(dāng) CaCl2濃度增加到0.2 mol/L (離子強(qiáng)度與0.5 mol/L NaCl相等) 時(shí)，Hb的回收率急劇下降，可能原因是 Ca2+比 Na+更有利于增強(qiáng)Hb與親和介質(zhì)之間的疏水作用，導(dǎo)致更多的Hb吸附到親和介質(zhì)上。

2.3.4蛋白質(zhì)種類的影響

采用 PMB親和介質(zhì)去除蛋白質(zhì)溶液中內(nèi)毒素的過程中，蛋白質(zhì)的疏水性強(qiáng)弱和帶電荷情況也會(huì)影響蛋白質(zhì)的非特異性吸附、蛋白質(zhì)與內(nèi)毒素之間的相互作用和內(nèi)毒素的去除效果。為了揭示蛋白質(zhì)特性的影響規(guī)律，實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步考察了不同 CaCl2濃度 (0～0.2 mol/L) 對(duì)HSA和LYS體系中內(nèi)毒素去除的影響，操作條件同“2.3.3”，結(jié)果如圖5所示。

對(duì)于含HSA的內(nèi)毒素體系，其去除率隨CaCl2濃度增大的變化趨勢(shì)與含Hb的內(nèi)毒素體系相似，但內(nèi)毒素去除率相對(duì)較低，尤其是當(dāng)CaCl2濃度為0.02 mol/L時(shí)，內(nèi)毒素去除率只有60.03% (對(duì)應(yīng)內(nèi)毒素濃度為166.97 EU/mL)，這是由于HSA在pH 8.0條件下帶有大量負(fù)電荷，Ca2+不僅促使了部分內(nèi)毒素分子通過橋接作用形成聚集體，還可促使內(nèi)毒素和帶負(fù)電荷的HSA通過橋接作用形成內(nèi)毒素-蛋白復(fù)合物，不利于內(nèi)毒素的吸附和去除。對(duì)于 HSA體系 (包括含和不含內(nèi)毒素2種體系)，隨著CaCl2濃度逐步增加，HSA回收率先升高后降低，變化趨勢(shì)與Hb相似。但HSA回收率的大小又與Hb明顯不同，不添加CaCl2時(shí)，HSA的回收率只有3.02%～3.34% (Hb回收率為 52.40%～57.55%)，這是由于HSA等電點(diǎn)在4.7～4.9，在pH 8.0條件下帶有大量負(fù)電荷，與親和介質(zhì)之間有更強(qiáng)的靜電作用。而隨著CaCl2的加入，HSA的回收率又快速上升到超過Hb的水平，這是由于HSA的疏水性小于Hb，在同等離子強(qiáng)度下，HSA與親和介質(zhì)之間的疏水作用小于Hb，故吸附量更小，回收率更高。

對(duì)于 LYS體系 (包括含和不含內(nèi)毒素 2種體系)，隨著CaCl2濃度逐步增加，LYS回收率總體呈上升趨勢(shì)。與Hb和HSA相比，LYS的回收率更高(78.64%～97.28%)，這是由于 LYS的疏水性比 Hb和HSA弱，與親和介質(zhì)之間的疏水作用力較弱。此外，LYS是一種堿性蛋白，等電點(diǎn)約為 11.0，所以在pH 8.0條件下，LYS與親和配基之間存在靜電排斥作用，一定程度上抑制了由疏水作用引起的吸附。LYS體系的內(nèi)毒素去除率隨 CaCl2濃度的變化趨勢(shì)與Hb和HSA體系相似，但去除率略有提高。

從3種蛋白體系 (Hb、HSA和LYS) 的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，去除內(nèi)毒素的親和介質(zhì)和蛋白質(zhì)之間均存在或多或少的靜電作用和疏水作用，引起蛋白質(zhì)在親和介質(zhì)上的吸附并導(dǎo)致蛋白回收率的降低。其中蛋白質(zhì)自身的等電點(diǎn)和疏水性對(duì)其在親和介質(zhì)上的吸附影響最大，堿性蛋白和弱疏水性蛋白 (如LYS)與親和介質(zhì)的相互作用最弱，吸附最少，回收率最高。此外，溶液的離子強(qiáng)度 (鹽濃度) 對(duì)蛋白質(zhì)和親和介質(zhì)之間的疏水和靜電作用的影響是相反的，增加離子強(qiáng)度有利于增強(qiáng)疏水作用，但卻會(huì)抑制靜電作用，所以隨著鹽濃度的增加，蛋白質(zhì)的回收率呈先升高后下降的變化趨勢(shì) (弱疏水性蛋白 LYS除外)。理論上，還可根據(jù)蛋白質(zhì)等電點(diǎn)選擇合適的pH條件，以改變蛋白質(zhì)的帶電性質(zhì) (正、負(fù)電荷) 及電荷多少，進(jìn)而調(diào)控蛋白質(zhì)與親和介質(zhì)間的靜電作用，減少蛋白質(zhì)在介質(zhì)上的吸附 (圖 2)。實(shí)際應(yīng)用中，應(yīng)根據(jù)蛋白的疏水性和等電點(diǎn)，并綜合考慮pH和鹽濃度對(duì)內(nèi)毒素去除和蛋白回收的影響，選擇合適的pH和鹽濃度條件，在確保高內(nèi)毒素去除率的前提下最大限度地提高蛋白的回收率。

圖5 CaCl2濃度對(duì)蛋白質(zhì)溶液中內(nèi)毒素去除的影響Fig.5 Effect of CaCl2concentration on endotoxin removal of protein solutions. (A) HSA solution. (B) LYS solution.

2.4 其他因素對(duì)水溶液中內(nèi)毒素去除的影響

除了上述主要影響因素外，其他操作條件如溫度、時(shí)間、內(nèi)毒素初始濃度、蛋白質(zhì)濃度、添加劑及介質(zhì)使用次數(shù)也會(huì)對(duì)內(nèi)毒素的去除產(chǎn)生一定影響。因此實(shí)驗(yàn)以水溶液為對(duì)象，又進(jìn)行了這些因素的考察。

2.4.1溫度的影響

分別考察了3種溫度 (4℃、25℃、37℃) 下，內(nèi)毒素的去除效果 (LPS濃度為835.54 EU/mL，緩沖體系為20 mmol/L PB+0.15 mol/L NaCl，pH 7.0，吸附時(shí)間為10 min)，結(jié)果如圖6所示。隨著溫度的升高，內(nèi)毒素去除率逐漸升高，這是由于升溫有利于加快內(nèi)毒素分子的布朗運(yùn)動(dòng)[22]，也有利于增強(qiáng)內(nèi)毒素與親和介質(zhì)間的疏水作用[20]，促進(jìn)內(nèi)毒素在介質(zhì)上的吸附。在所考察的溫度范圍內(nèi)，內(nèi)毒素去除率均能達(dá)到 99%以上的水平 (對(duì)應(yīng)內(nèi)毒素含量均在3.25 EU/mL以下)，高于文獻(xiàn)報(bào)道的87%～99%的水平[22]。鑒于低溫 (4℃) 通常有利于蛋白穩(wěn)定性的保持，同時(shí)也能取得很好的內(nèi)毒素去除效果，因此可在低溫條件下進(jìn)行蛋白質(zhì)溶液中內(nèi)毒素的去除操作，以便于提高蛋白的穩(wěn)定性和回收率。

圖6 溫度對(duì)內(nèi)毒素去除的影響Fig.6 Effect of temperature on endotoxin removal.

2.4.2時(shí)間的影響

分別考察了不同吸附時(shí)間 (2 min～24 h) 下，內(nèi)毒素的去除效果 (LPS濃度為417.77 EU/mL，緩沖體系為20 mmol/L PB+0.15 mol/L NaCl，pH 7.0，吸附溫度為4℃)，結(jié)果如圖7所示。吸附時(shí)間越長(zhǎng)，內(nèi)毒素去除率越高。吸附作用不僅發(fā)生在介質(zhì)的外表面，還發(fā)生在介質(zhì)內(nèi)部孔道的表面，吸附時(shí)間越長(zhǎng)，內(nèi)毒素在介質(zhì)內(nèi)部孔道的擴(kuò)散越充分，吸附越徹底，去除率越高。當(dāng)吸附時(shí)間達(dá)到 15 min，內(nèi)毒素含量即可降至1 EU/mL以下；當(dāng)吸附時(shí)間達(dá)到4 h，內(nèi)毒素含量即可降至0.1 EU/mL以下。

圖7 吸附時(shí)間對(duì)內(nèi)毒素去除的影響Fig.7 Effect of time on endotoxin removal.

2.4.3內(nèi)毒素濃度的影響

分別考察了不同內(nèi)毒素濃度 (8.3554～41 777.0 EU/mL) 對(duì)內(nèi)毒素去除的影響 (緩沖體系為20 mmol/L PB+0.15 mol/L NaCl，pH 7.0，吸附溫度為4℃，吸附時(shí)間為4 h)，結(jié)果如圖8所示。隨著初始內(nèi)毒素濃度逐漸增加，吸附后內(nèi)毒素濃度也逐漸增大，且去除率略有下降，但變化不大，均在99.4%以上，當(dāng)初始內(nèi)毒素濃度為4 177.7 EU/mL時(shí)，吸附后內(nèi)毒素濃度為 5.7 EU/mL，而當(dāng)初始內(nèi)毒素濃度為1 671.08 EU/mL時(shí)，吸附后內(nèi)毒素濃度可降為0.47 EU/mL，對(duì)應(yīng)去除率分別為99.86%和99.77%。由此可見，在去除率不低于 99%的情況下，PMB QZT FF親和介質(zhì)的載量可達(dá)到600 000 EU LPS/mL介質(zhì)的水平 (1 g抽干的膠相當(dāng)于1.4 mL)，實(shí)際應(yīng)用中可根據(jù)要求適當(dāng)調(diào)整吸附量以使最終內(nèi)毒素殘留量達(dá)標(biāo)。

圖8 初始內(nèi)毒素濃度對(duì)內(nèi)毒素去除的影響Fig.8 Effect of endotoxin initial concentration on endotoxin removal.

2.4.4蛋白質(zhì)濃度的影響

以Hb為模型蛋白，考察了不同Hb濃度 (0～2.0 mg/mL) 對(duì)內(nèi)毒素去除及蛋白回收的影響 (LPS濃度為 417.77 EU/mL，緩沖體系為 20 mmol/L PB+0.15 mol/L NaCl，pH 7.0，吸附溫度為4℃，吸附時(shí)間為4 h)，結(jié)果如圖9所示。隨著體系中Hb濃度的逐漸增大，內(nèi)毒素的去除率出現(xiàn)輕微的下降，但變化幅度很小，去除率均在 99.8%以上 (內(nèi)毒素濃度均在0.70 EU/mL以下)。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[27]，Hb和內(nèi)毒素之間存在相互作用，Hb的加入可促使內(nèi)毒素聚集體解聚成單體，并與Hb形成內(nèi)毒素-Hb復(fù)合物，而復(fù)合物和親和介質(zhì)之間的作用力弱于內(nèi)毒素，相對(duì)不易被吸附。隨著Hb濃度的升高，內(nèi)毒素-Hb復(fù)合物有所增加，故內(nèi)毒素去除率會(huì)降低，但形成內(nèi)毒素-Hb復(fù)合物的內(nèi)毒素只占很小的比率，所以其去除率只有輕微下降。此外，吸附后Hb有不同程度的損失，表明親和介質(zhì)對(duì)Hb有一定的吸附 (疏水作用和靜電作用)。隨著Hb濃度的增加，Hb吸附到介質(zhì)上的量 (絕對(duì)量) 逐步增加，但回收率 (相對(duì)量) 也逐步增加。

2.4.5添加劑的影響

內(nèi)毒素在溶液中容易形成分子量高達(dá) 40萬至100萬不等的聚集體、膠束或膠囊[4]，而表面活性劑如Triton、脫氧膽酸鈉 (DOS) 及螯合劑EDTA等，可將內(nèi)毒素聚集體解聚為單體，也可打開內(nèi)毒素-蛋白質(zhì)復(fù)合物[28]。相關(guān)的研究表明在內(nèi)毒素的去除過程中加入上述添加劑，可以提高內(nèi)毒素的去除效果[11-13,29]，但添加劑的后續(xù)去除是一個(gè)問題。此外，添加劑是否會(huì)干擾內(nèi)毒素的檢測(cè)，造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果的失真也未見相關(guān)報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)首先考察了5種添加劑對(duì)內(nèi)毒素檢測(cè)的影響，結(jié)果如表3所示。添加劑對(duì)內(nèi)毒素檢測(cè)的干擾極大，其中尿素和EDTA導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果偏高0.26和0.67倍，而SDS、DOS和Triton X-100導(dǎo)致檢測(cè)值降低至原來的 0.06%、0.53%和 0.96%。隨后考察了添加劑對(duì)內(nèi)毒素去除的影響，結(jié)果表明在所考察的濃度條件下，尿素和EDTA的加入導(dǎo)致內(nèi)毒素去除率出現(xiàn)輕微的下降 (將添加劑對(duì)內(nèi)毒素測(cè)定的干擾計(jì)算在內(nèi)，下同)；DOS的加入導(dǎo)致內(nèi)毒素去除率出現(xiàn)顯著的下降；而SDS和Triton X-100的影響尚不清楚。

表3 添加劑對(duì)內(nèi)毒素檢測(cè)的影響Table 3 Effect of additives on endotoxin assay

表4 添加劑對(duì)內(nèi)毒素去除效果的影響Table 4 Effect of additives on endotoxin removal

2.4.6介質(zhì)使用次數(shù)的影響

考察了介質(zhì)使用次數(shù)對(duì)內(nèi)毒素去除的影響(LPS濃度為417.77 EU/mL，緩沖體系為20 mmol/L PB+0.15 mol/L NaCl，pH 7.0，吸附溫度為4℃，吸附時(shí)間為1 h)，結(jié)果如圖10所示。隨著介質(zhì)使用次數(shù)的增加，內(nèi)毒素的去除率只有輕微的下降，但第3次使用時(shí)仍能達(dá)到99.66%的內(nèi)毒素去除率，內(nèi)毒素殘留量低至1.40 EU/mL，可以滿足實(shí)際應(yīng)用的需要。

圖10 介質(zhì)使用次數(shù)對(duì)內(nèi)毒素去除的影響Fig.10 Effect of using times on endotoxin removal.

3 結(jié)論

本研究采用合成的PMB QZT FF親和介質(zhì)對(duì)不同蛋白質(zhì)溶液中的內(nèi)毒素進(jìn)行去除，重點(diǎn)考察了親和介質(zhì) (間隔臂長(zhǎng)度和配基密度)、溶液條件 (pH值、NaCl濃度、CaCl2濃度) 和蛋白特性 (等電點(diǎn)和疏水性) 對(duì)內(nèi)毒素去除率和蛋白回收率的影響，探討了各種影響因素的作用機(jī)制，得出了如下結(jié)論：

1) PMB QZT FF親和介質(zhì)具有載量大(600 000 EU LPS/mL介質(zhì))、吸附速度快 (5～10 min)、去除率高 (99%以上)、可重復(fù)使用的特點(diǎn)。

2) 在pH 5～9的范圍內(nèi)，內(nèi)毒素去除率均保持在98%以上，其中中性和弱堿性條件 (pH 7～8) 更有利于內(nèi)毒素的去除 (99.9%以上)；pH通過改變蛋白的帶電性質(zhì)影響蛋白與親和介質(zhì)間的靜電作用，從而影響蛋白的回收率，因此，pH的選擇對(duì)蛋白的有效回收極為關(guān)鍵。

3) 鹽濃度的改變導(dǎo)致內(nèi)毒素與親和介質(zhì)、蛋白與親和介質(zhì)之間的靜電作用和疏水作用同時(shí)發(fā)生變化，隨著鹽濃度的增加，兩種因素的協(xié)同作用使內(nèi)毒素去除率呈先下降后上升的趨勢(shì)，蛋白回收率呈先上升后下降的趨勢(shì)，表明內(nèi)毒素及蛋白與親和介質(zhì)之間的作用力均以靜電作用為主，疏水等相互作用為輔；在同等離子強(qiáng)度下，NaCl和CaCl2兩種鹽對(duì)內(nèi)毒素去除率和蛋白回收率的影響基本相似。

4) 蛋白等電點(diǎn)的高低和疏水性的強(qiáng)弱是決定蛋白回收率高低的主要因素，其中弱疏水性蛋白和堿性蛋白在親和介質(zhì)上的吸附更少，回收率更高；可根據(jù)蛋白的等電點(diǎn)和疏水性調(diào)節(jié)溶液條件 (pH值、鹽濃度) 來提高蛋白的回收率。

5) 蛋白質(zhì)的加入導(dǎo)致內(nèi)毒素去除率的輕微下降，表明內(nèi)毒素和蛋白質(zhì)之間具有一定的相互作用(如形成內(nèi)毒素-蛋白復(fù)合物)，影響內(nèi)毒素的去除。

6) 添加劑對(duì)內(nèi)毒素檢測(cè)的干擾極大，其對(duì)內(nèi)毒素去除的影響還有待于進(jìn)一步研究。

REFERENCES

[1] Erridge C, Bennett-Guerrero E, Poxton IR. Structure and function of lipopolysaccharides.Microb Infect, 2002, 4:837?851.

[2] Daneshiam M, Guenther A, Wendel A,et al.In vitropyrogen test for toxic or immunological drugs.J Immunol Methods, 2006, 313: 169?175.

[3] United States Pharmacopoeia-National Formulary. USP 30-NF 25. United States Pharmacopeial Convention, 2007.

[4] Petsch D, Anspach FB. Endotoxin removal from protein solutions.J Biotechnol, 2000, 76: 97?119.

[5] Liu S, Tobias R, McClure S,et al. Removal of endotoxin from recombinant protein preparations.Clin Biochem,1997, 30: 455?463.

[6] Sch?dlich L, Senger T, Kirschning CJ,et al. Refining HPV16 L1 purification fromE. coli: reducing endotoxin contaminations and their impact on immunogenicity.Vaccine, 2009, 27: 1511?1522.

[7] Li L, Luo RG. Use of Ca2+to aggregate lipopolysaccharides (LPS) in hemoglobin solutions and the subsequent removal of endotoxin by ultrafiltration.Biotechnol Tech, 1998, 12: 119?122.

[8] Pyo SH, Lee JH, Park HB,et al. A large-scale purification of recombinant histone H1.5 fromEscherichia coli.Protein Exp Purif, 2001, 23: 38?44.

[9] Fiske MJ, Fredenburg RA, VanDerMeid KR,et al. Method for reducing endotoxin inMoraxella catarrhalisUspA2 protein preparations.J Chromatogr B, 2001, 753:269?278.

[10] Xu XR, Ma GC, Wang CM,et al. Removing endotoxin from rHSA-IFNa2b by chromatography.Chin J Biotech,2008, 24(1): 159?163.

徐向榮, 馬國(guó)昌, 王昌梅, 等. 層析法去除重組人血清白蛋白干擾素 a2b融合蛋白的內(nèi)毒素. 生物工程學(xué)報(bào),2008, 24(1): 159?163.

[11] Pi WH, Sun CJ, Song ZQ,et al. Purification of plasmid DNA using anion-exchange chromatography and removal of endotoxin with Triton X-114 or Triton X-100.Chin J Chromatogr, 2007, 25: 809?813.

[12] Chen RH, Huang CJ, Newton BS,et al. Factors affecting endotoxin removal from recombinant therapeutic proteins by anion exchange chromatography.Protein Exp Purif,2009, 64: 76?81.

[13] Wilson MJ, Haggart CL, Gallagher SP,et al. Removal of tightly bound endotoxin from biological products.J Biotechnol, 2001, 88: 67?75.

[14] Freitas SS, Santos JAL, Prazeres DMF. Plasmid purification by hydrophobic interaction chromatography using sodium citrate in the mobile phase.Sep Purif Technol, 2009, 65: 95?104.

[15] Anspach FB. Endotoxin removal by affinity sorbents.J Biochem Bioph Methods, 2001, 49: 665?681.

[16] Magalh?esl PO, Lopes AM, Mazzola PG,et al. Methods of endotoxin removal from biological preparations: a review.J Pharm Sci, 2007, 10: 388?404.

[17] Anspach FB, Hilbeck O. Removal of endotoxins by affinity sorbents.J Chromatogr A, 1995, 711: 81?92.

[18] Montbriand PM, Malone RW. Improved method for the removal of endotoxin from DNA.J Biotechnol, 1996, 44:43?46.

[19] Issekutz AC. Removal of gram-negative endotoxin from solutions by affinity chromatography.Immunol Methods,1983, 61: 275?281.

[20] Tang SW, Kong L, Ou JJ,et al. Study on endotoxin removal by affinity chromatography.Chin J Ana Chem,2006, 34(4): 455?458.

唐守萬, 孔亮, 歐俊杰, 等. 柱親和介質(zhì)用于內(nèi)毒素去除的研究. 分析化學(xué), 2006, 34(4): 455?458.

[21] Lahiri VL, Srivastava RK, Hazra DK,et al. Removal of endotoxin from antibody preparations for clinical use.Cell Biophysics, 1994, 24(25): 9?14.

[22] Yu HH, Nakase I, Pujals SP,et al. Expressed protein ligation for the preparation of fusion proteins with cell penetrating peptides for endotoxin removal and intracellular delivery.Biochim Biophys Acta, 2010, doi:10. 1016/j. bbamem. 2010. 02. 003.

[23] Elass-Rochard E, Roseanu A, Legrand D,et al.Lactoferrin-lipopolysaccharide interaction: involvement of the 28-34 loop region of human lactoferrin in the high-affinity binding toEscherichia coli055B5 lipopolysaccharide.J Biochem,1995, 312(3): 839?845.

[24] Wieslaw K, Robert IR, Jack L. Hemoglobin, a newly recognized lipopolysaccharide (LPS)-binding protein that enhances LPS biological activity.J Biol Chem, 1994,269(40): 25078?25084.

[25] Nation Pharmacopeia Committee. Pharmacopoeia of the People’s Republic of China (3rd Part). Beijing: Chemincal Industry Publishing Company, 2005.

國(guó)家藥典委員會(huì)編. 中華人民共和國(guó)藥典(第三部). 北京: 化工出版集團(tuán), 2005.

[26] Hirayama CC, Masayo S. Chromatographic removal of endotoxin from protein solutions by polymer particles.J Biol Chem, 2002, 781: 419?432.

[27] Li LP, Luo RG. Protein concentration effect on protein-lipopolysaccharide (LPS) binding and endotoxin removal.Biotechnol Lett, 1997, 19(2): 135?138.

[28] Hirayama CC, Masayo S. Chromatographic removal of endotoxin from protein solutions by polymer particles.J Biol Chem, 2002, 781: 419?432.

[29] Jang HJ, Kim HS, Moon SC,et al. Effects of protein concentration and detergent on endotoxin reduction by ultrafiltration.BMB Reports, 2009, 42(7): 462?466.

Effect of affinity medium and solution conditions on endotoxin removal from protein solutions

Haixin Xing1,2, Yongdong Huang2,3, Yan Li2, Jian Luo2, Liye Zhang1, Guanghui Ma2, and Zhiguo Su2

1College of Life Science and Technology,Beijing University of Chemical Technology,Beijing100029,China
2National Key Laboratory of Biochemical Engineering,Institute of Process Engineering,Chinese Academy of Sciences,Beijing100190,China
3National Engineering Research Centre for Biotechnology,Institute of Process Engineering,Chinese Academy of Sciences,Beijing100190,China

Received:March 18, 2010;Accepted:May 17, 2010

Supported by:National Natural Science Foundation of China (No. 20906094), National High Technology Research and Development Program of China (863 Program) (No. 2007AA100506).

Corresponding author:Yongdong Huang. Tel: +86-10-62561817; Fax: +86-10-62561813; E-mail: ydhuang@home.ipe.ac.cn

Zhiguo Su. E-mail: zgsu@home.ipe.ac.cn

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目 (No. 20906094)，國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃 (863計(jì)劃) (No. 2007AA100506) 資助。