王婷婷，王淑娟，嚴景華

1 中國科學(xué)院微生物研究所 中國科學(xué)院病原微生物與免疫學(xué)重點實驗室，北京 100101

2 中國科學(xué)院研究生院，北京 100049

3 中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，青島 266032

醫(yī)學(xué)與免疫生物技術(shù)

hNoc4L基因重組慢病毒表達載體的構(gòu)建與鑒定

王婷婷1,2，王淑娟3，嚴景華1

1 中國科學(xué)院微生物研究所 中國科學(xué)院病原微生物與免疫學(xué)重點實驗室，北京 100101

2 中國科學(xué)院研究生院，北京 100049

3 中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，青島 266032

核糖體前體的形成和核運輸需要多種核仁復(fù)合物的參與，hNoc4L是釀酒酵母S. cerevisiae的核仁復(fù)合物相關(guān)蛋白4的同源蛋白，并含有保守的Noc結(jié)構(gòu)域，但其功能未知。為了構(gòu)建hNoc4L基因過表達的慢病毒載體，本實驗通過將EF1α啟動子替換原shRNA慢病毒載體pll3.7的U6啟動子，成功構(gòu)建了慢病毒表達載體pll3.7-EF1，并進一步得到了hNoc4L基因過表達的慢病毒載體。利用慢病毒包裝系統(tǒng)對不同物種的細胞進行感染，以此檢測該重組慢病毒載體的包裝效率，并通過構(gòu)建的hNoc4L過表達的RAW264.7穩(wěn)定細胞系檢測了該載體的免疫原性和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染能力。結(jié)果表明成功構(gòu)建了高效、長期穩(wěn)定表達和免疫原性低的hNoc4L特異性表達的慢病毒載體，為進一步研究hNoc4L蛋白在哺乳動物核糖體生物發(fā)生中的調(diào)控作用奠定了基礎(chǔ)。

hNoc4L基因，慢病毒表達載體，核糖體生物發(fā)生

Abstract:Formation and nuclear export of pre-ribosomes requires many nucleolar complexes. hNoc4L which contains a conserved Noc doman is a homolog of nucleolar complex associated 4 (S. cerevisiae), but its function is completely unclear. Here, we successfully got the recombinant lentiviral vector pll3.7-EF1-hNoc4L-Flag by replacing the U6 promoter in pll3.7 with EF1α promoter, and then insertedhNoc4Lto down-stream of the EF1α prompter. We determined the transduction efficiency in different mammalian cell lines based on lentiviral packaging system. Subsequently, we analyzed the immunogenicity of the recombinant lentivirus and stable expression ofhNoc4Lin RAW264.7 cells.The results showed that the recombinant lentivirus characterized a high transduction efficiency, long-term expression and low immunogenicity. Therefore, we pave the way for further identification of the biological activity of hNoc4L protein during ribosome biogenesis in mammalian.

Keywords:hNoc4Lgene, lentiviral expression system, ribosome biosynthesis

從細菌到人類所有生命的細胞中都存在著成千上萬的核糖體，核糖體是蛋白質(zhì)的翻譯場所，負責(zé)細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的合成，對細胞的生長、組織的分化和發(fā)育十分重要。細胞的大部分物質(zhì)與能量都用于核糖體的合成，正在生長的細胞中，與核糖體生物發(fā)生相關(guān)的基因的轉(zhuǎn)錄約占整個細胞轉(zhuǎn)錄體系的60%以上[1]。由此可知，對核糖體生物合成的調(diào)控是細胞調(diào)控的關(guān)鍵步驟。目前，對于真核生物核糖體生物發(fā)生的基本過程已有初步的認識，但其中詳細的機制尚不清楚，仍是一個研究熱點。

在真核生物中，核糖體的生物發(fā)生是一個高度復(fù)雜和協(xié)同進行的過程，發(fā)生在不同的亞細胞器中，需要3種RNA聚合酶共同協(xié)調(diào)轉(zhuǎn)錄上百個基因，其中包括核仁區(qū)的 RNA聚合酶Ⅰ負責(zé)轉(zhuǎn)錄的pre-rRNA，細胞質(zhì)中的RNA聚合酶Ⅱ負責(zé)轉(zhuǎn)錄的核糖體蛋白基因以及細胞核內(nèi)的 RNA聚合酶Ⅲ負責(zé)轉(zhuǎn)錄的5S rRNA[2]。對酵母的研究發(fā)現(xiàn)，核糖體的生物發(fā)生主要在核仁里，后期的成熟過程是在細胞核和細胞質(zhì)中進行的，主要為pre-rRNA經(jīng)過多種剪切、修飾等步驟加工為成熟的 18S、5.8S和28S rRNA，與進入核仁的5S rRNA以及來自細胞質(zhì)的多種相關(guān)蛋白質(zhì)相結(jié)合，組裝成核糖體的大小亞基的前體，再分別轉(zhuǎn)運至細胞質(zhì)中進一步成熟，組裝成有功能的核糖體[3-4]。

在核糖體的大小亞基的組裝、運輸和成熟的過程中，反式調(diào)控因子發(fā)揮著十分重要的作用[5-7]，Noc(Nucleolar complex) 類蛋白復(fù)合物就是新發(fā)現(xiàn)的影響核糖體成熟和核運輸?shù)闹匾姆词秸{(diào)控因子。Noc類蛋白是一類核仁復(fù)合物相關(guān)蛋白，在以酵母為模式生物的研究中發(fā)現(xiàn)，Noc1、Noc3和Noc4均有一個由45個氨基酸組成的保守的Noc結(jié)構(gòu)域[8-9]，其中Noc1-Noc2和Noc3-Noc2異源二聚體在60S核糖體前體的成熟和出核運輸中發(fā)揮重要作用，而Noc4-Nop14 (Nucleolar protein 14) 異源二聚體在40S核糖體前體的成熟和核運輸中發(fā)揮重要作用[9]。hNoc4L(Human nucleolar complex associated 4 homolog)，人核孔復(fù)合物蛋白4同源體，NCBI編號為Homo sapiens (mRNA，MGC3162)，其編碼產(chǎn)物為516個氨基酸組成的多次跨膜蛋白hNoc4L，與酵母 Noc4有相同的保守的 Noc結(jié)構(gòu)域，但其功能尚未有研究報道。因此本文構(gòu)建了hNoc4L基因特異性表達的慢病毒載體，該重組病毒能感染小鼠成纖維細胞 NIH3T3、猴腎細胞 Marc145、小鼠巨噬細胞RAW264.7和狗腎細胞 MDCK，并得到了穩(wěn)定表達hNoc4L基因的 RAW264.7細胞株，檢測了重組病毒的感染效率及免疫原性，為后續(xù)研究 hNoc4L蛋白的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞株

人胚腎細胞293T、猴腎細胞Marc145、狗腎細胞MDCK、小鼠成纖維細胞NIH3T3和小鼠巨噬細胞系RAW264.7細胞，均為本實驗室保存。

1.1.2菌種與載體

大腸桿菌 DH5α為本實驗室保存，質(zhì)粒pEF-BOS、pcDNA3.0-hNoc4L-Flag為本實驗室保存，shRNA慢病毒載體 pll3.7、包裝質(zhì)粒 pLP1、pLP2和pLP/VSVG由中國科學(xué)院微生物研究所高斌研究員惠贈。pMD-18T載體購自TaKaRa公司。

1.1.3工具酶及其他

DNA聚合酶、各種限制性內(nèi)切酶均購自TaKaRa公司；轉(zhuǎn)染試劑PEI購自ROCHE公司，Polybrene購自INTROVIGEN公司；去內(nèi)毒素超純質(zhì)粒大提試劑盒購自博大泰克生物技術(shù)公司，DNA凝膠回收純化試劑盒購自O(shè)MEG公司，完全培養(yǎng)基為含10%胎牛血清 (FBS) 的DMEM培養(yǎng)基，為GIBCO產(chǎn)品；小鼠IL-6和TNF-α ELISA預(yù)包被試劑盒購自北京達科為生物技術(shù)公司。

1.2 方法

1.2.1重組質(zhì)粒的構(gòu)建[10]

真核表達載體 pll3.7-EF1的構(gòu)建：首先，PCR獲得EF1α啟動子全序列，即以pEF-BOS為模板，以 F1、R1為引物擴增 EF1α啟動子全序列。PCR反應(yīng)參數(shù)：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸2 min，30個循環(huán)；72℃延伸10 min，16℃保溫5 min。用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定并分離產(chǎn)物，應(yīng)用OMEG公司的DNA凝膠回收試劑盒回收并純化EF1α啟動子片段，目的片段大小約1 200 bp。用T4 DNA連接酶將目的片段連接到pMD-18T載體上并轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細胞，挑取克隆進行菌液PCR和雙酶切鑒定正確后，進行測序。用XbaI和XhoI對質(zhì)粒pll3.7雙酶切以切除U6啟動子，凝膠電泳回收純化pll3.7的片段。酶切后pll3.7的大小約為 7 100 bp。同樣的方法對質(zhì)粒 pMD-18T-EF1α進行雙酶切，回收EF1α片段。將兩者用T4 DNA連接酶連接，對所得克隆進行菌液PCR和雙酶切鑒定，獲得重組質(zhì)粒pll3.7-EF1，構(gòu)建結(jié)構(gòu)圖見圖 1。所用引物如下(5′?3′)：F1: GCTCTAGAC GTGAGGCTCCGGTGCCCGTC；R1: CCGCTCGAG TCACGACACCTGAAATGGAA。

重組表達載體pll3.7-EF1-hNoc4L-Flag的構(gòu)建：用XhoI和NotI對質(zhì)粒 pll3.7-EF1和 pcDNA3.0-hNoc4L-Flag進行雙酶切，DNA凝膠電泳回收純化pll3.7-EF1和hNoc4-Flag-His的片段。將兩者用T4 DNA連接酶連接轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細胞，對所得克隆進行菌液 PCR和雙酶切鑒定，獲得重組質(zhì)粒pll3.7-EF1-hNoc4L-Flag。

圖1 重組質(zhì)粒載體的構(gòu)建示意圖Fig.1 Construction of recombinant plasmids. A: EF-1α; B: pll3.7-U6; C: hNoc4L-Flag-his.

1.2.2重組慢病毒的包裝

重組表達型慢病毒載體pll3.7-EF1-hNoc4L-Flag、包裝質(zhì)粒pLP1、pLP2和pLP/VSVG分別用試劑盒進行超純?nèi)?nèi)毒素大量提取，利用 PEI法共轉(zhuǎn)染HEK 293T細胞。轉(zhuǎn)染主要步驟 (以10 cm培養(yǎng)皿為例)：將 18 μg質(zhì)粒 (載體和包裝質(zhì)粒各 4.5 μg) 和144 μg PEI分別溶于生理鹽水中，使其終體積均為200 μL，混勻；靜置5 min后，將兩者混合，再靜置20 min，將質(zhì)粒-PEI混合物逐滴加入到細胞培養(yǎng)皿中，4～6 h后更換新鮮的完全培養(yǎng)基 (DMEM+ 10%FBS，下同)。轉(zhuǎn)染 24 h后，在倒置熒光顯微鏡下觀察細胞的綠色熒光蛋白的表達情況，確認轉(zhuǎn)染成功后，收集48～72 h病毒上清。3 000 r/min低速離心15 min去除細胞碎片，短期4℃保存?zhèn)溆茫L期保存則1 mL分裝，于?80℃保存。

1.2.3重組病毒感染不同來源的細胞

將293T細胞接種于6孔板中，以培養(yǎng)24 h后細胞密度達到 30%～40%為宜。移去培養(yǎng)基，加入收集的病毒上清1 mL，補加1 mL新鮮的完全培養(yǎng)基，并加入Polybrene，使其終濃度為8 μg/mL，感染8 h后，更換為新鮮的完全培養(yǎng)基。感染48 h后熒光顯微鏡下觀察是否可見綠色熒光。病毒成功包裝后，同樣方法分別感染Marc145、MDCK、NIH3T3和RAW264.7細胞，并于48 h后觀察感染情況。

1.2.4過表達hNoc4L的RAW264.7穩(wěn)定細胞株的構(gòu)建

將假病毒感染的 RAW264.7細胞通過流式細胞儀進行分選，得到hNoc4L基因過表達的多克隆細胞。將得到的陽性細胞進行培養(yǎng)，并檢測靜息狀態(tài)下的不同 RAW264.7細胞株的細胞因子分泌情況，具體檢測方法見1.2.5。培養(yǎng)30 d后，在熒光顯微鏡下觀察穩(wěn)定細胞株的陽性情況，并通過 Western blotting檢測hNoc4L基因的表達情況。

1.2.5ELISA法檢測RAW264.7穩(wěn)定克隆株的細胞因子IL-6和TNF-α的分泌

本過程中使用的是達科為生物技術(shù)有限公司自主研發(fā)的ELISA預(yù)包被減步法試劑盒，原理為雙抗體夾心法。步驟為：將104個細胞接種于48孔板，每種細胞設(shè)置3個重復(fù)。培養(yǎng)8 h后收集細胞上清，按照試劑盒的要求進行操作。以試劑盒配備的標準品制作標準曲線 (0 pg/mL、31.25 pg/mL、62.5 pg/mL、125 pg/mL、250 pg/mL和500 pg/mL)。通過標準曲線計算細胞上清中 IL-6和 TNF-α的含量。以加入100 ng/mL LPS刺激的RAW264.7細胞作陽性對照。

1.2.6Western blotting檢測目的基因hNoc4L的表達情況

用裂解緩沖液 (0.5% NP-40的PBS，含蛋白酶抑制劑混合物) 裂解細胞，離心取上清，加入上樣緩沖液 (含DTT)，100℃處理5 min；各取15 μL上樣進行 SDS-PAGE 電泳 (80 V，30 min；120 V，1 h)；轉(zhuǎn)膜 (200 mA，1 h)；含5%脫脂奶粉的TBS封閉1 h，加入含有anti-Flag (1∶1 000) 的封閉液搖動1～2 h；用 TBST (含0.5‰ Tween-20) 洗 3次；用含有IgG-HRP (1∶5 000) 的封閉液搖動1 h；用TBST洗3次；將膜晾干，加顯色液于膜上，用封口膜將膜包住放入暗盒內(nèi)，加入X光膠片，進行曝光、顯影和定影。

2 結(jié)果

2.1 真核表達載體pll3.7-EF1以及hNoc4L基因特異性表達的重組慢病毒載體的構(gòu)建與表達：

以pEF-BOS為模板，將PCR擴增出的EF1α片段插入到pMD-18T載體上，雙酶切得到的陽性克隆質(zhì)粒，回收目的片段，在將其插入到 pll3.7載體的XbaI和XhoI之間，所挑取的克隆經(jīng)XbaI和XhoI雙酶切鑒定，切出約1 184 bp的條帶，構(gòu)建的慢病毒表達載體pll3.7-EF1經(jīng)測序鑒定正確。以pcDNA3.0-hNoc4L-Flag為模板酶切出的hNoc4L-Flag-his6片段插入到pll3.7-EF1α的XbaI和XhoI之間，所挑的陽性克隆經(jīng)酶切得到約1 592 bp的片段，與目的片段大小相符，且測序正確。由于pll3.7-EF1-hNoc4LFlag包含有由CMV啟動子啟動的GFP基因，因此，可以通過熒光顯微鏡觀察重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率及重組病毒的感染效率。將構(gòu)建成功的載體用PEI法瞬時轉(zhuǎn)染293T細胞，24 h后，在熒光顯微鏡下能觀察到大部分細胞都被成功轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒，收集已成功轉(zhuǎn)染的293T細胞，并通過Western blotting檢測到hNoc4L基因的成功表達(圖2)。

圖2 重組質(zhì)粒載體的構(gòu)建與表達鑒定Fig.2 The construction and expression of recombinant plasmids. (A) Double digestion of recombinant plasmids pll3.7-EF1 (M1:marker DL2000; M2: marker 1 kb DNA ladder; 1?5: five repeats). (B) pll3.7-EF1-hNoc4L-Flag (M1: marker DL2000; M2: marker 1 kb DNA ladder; 1?3: three repeats). (C) Transfecting pll3.7-EF1-hNOC4L-Flag in 293T cells. (D) Western blotting analyze ofhNOC4Lgene (lane 1: pll3.7-EF1 in 293T cells; lane 2: pll3.7-EF1-hNoc4L-Flag in 293T cells).

2.2 重組慢病毒的包裝及鑒定

將重組表達型慢病毒載體 pll3.7-EF1-hNoc4LFlag和病毒包裝質(zhì)粒pLP1、pLP2和pLP/VSVG共轉(zhuǎn)染293T細胞，24 h后可觀察到綠色熒光蛋白的表達，且轉(zhuǎn)染效率較高 (數(shù)據(jù)未顯示)。繼續(xù)培養(yǎng)細胞，72 h后收集病毒上清，并感染293T細胞，將已感染的細胞培養(yǎng)48 h后在倒置熒光顯微鏡下可觀察到綠色熒光，說明重組慢病毒已成功生產(chǎn) (圖 3)。將同一視野自然光和熒光下的圖片進行比對發(fā)現(xiàn)，重組慢病毒載體可以高效感染293T細胞。

圖3 重組慢病毒對不同細胞的感染后觀察EGFP的表達Fig.3 EGFP expression after transducing recombinant lentiviral construct into the mammalian cell lines of choice under light microscope and fluorescence microscope.

2.3 慢病毒假病毒對不同細胞的感染結(jié)果

近年來，一些研究表明，索氏的“語言”實際上是科學(xué)主義的產(chǎn)物[20-21]。所謂科學(xué)主義，是指主張把自然科學(xué)的方法應(yīng)用于人文社會科學(xué)在內(nèi)的一切研究領(lǐng)域的觀點?？茖W(xué)研究往往需要去除各種“雜質(zhì)”的影響，索緒爾的語言學(xué)理論中含有科學(xué)主義的因素，他提出的變革方法就是要開展一場“同質(zhì)化”運動”[22]364。這里我們有必要深究兩個問題：(1)社會科學(xué)為什么要去除雜質(zhì)，開展同質(zhì)化運動？(2)社會科學(xué)是如何去除雜質(zhì)，達到同質(zhì)化這一目的的？

為了進一步檢驗重組慢病毒表達載體對不同細胞的感染情況，用收集的病毒分別感染 4種不同物種來源的細胞系：猴腎細胞 Marc145、狗腎細胞MDCK、小鼠成纖維細胞 NIH3T3和小鼠巨噬細胞RAW264.7。感染 48 h后倒置熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)這 4種細胞均可見綠色熒光 (圖 3)，說明包裝出的慢病毒能成功感染目標細胞，其中 Marc145、MDCK及 NIH3T3細胞有較高的感染效率，而RAW264.7細胞感染效率較低。

2.4 過表達hNoc4L基因的 RAW264.7穩(wěn)定細胞系的構(gòu)建以及細胞特性的鑒定

感染重組病毒的RAW264.7細胞經(jīng)過3周的培養(yǎng)后，通過流式細胞儀分選，得到了hNoc4L基因過表達的穩(wěn)定細胞系 (圖4)。RAW264.7細胞是小鼠巨噬細胞系，有外界刺激時會釋放大量的炎癥因子。為了了解病毒感染 RAW264.7細胞是否會引起細胞強烈的免疫原性，我們用ELISA法檢測了RAW264.7細胞及 hNoc4L過表達的穩(wěn)定細胞系靜息狀態(tài)的細胞因子IL-6和TNF-α的分泌情況 (表1)。結(jié)果顯示，與沒有感染病毒的RAW264.7細胞相比，重組慢病毒感染的 RAW264.7細胞 (包括 RAW264.7-pll3.7-EF1及 RAW264.7-pll3.7-EF1-hNoc4L-Flag) 的 TNF-α 和IL-6的含量都沒有升高，表明構(gòu)建的重組病毒沒有引起 RAW264.7細胞發(fā)生明顯的免疫反應(yīng)。為了檢測hNoc4L基因在細胞中的持續(xù)表達情況，我們將上述細胞株連續(xù)培養(yǎng)30 d后收集該細胞，用Flag抗體檢測hNoc4L蛋白的表達，在約57 kDa大小處檢測到特征帶，符合預(yù)期大小，說明hNoc4L基因成功地穩(wěn)定表達 (圖 5)。用熒光顯微鏡觀察，同一視野自然光和熒光對比發(fā)現(xiàn)細胞的陽性率無明顯改變 (數(shù)據(jù)未顯示)。

圖4 穩(wěn)定表達hNoc4L基因的RAW264.7細胞系Fig.4 Stable expression ofhNoc4Lgene in RAW264.7 cell line.

表1 ELISA檢測 RAW264.7和hNoc4L穩(wěn)定細胞系的IL-6和TNF-α分泌情況Table 1 Determination of IL-6 and TNF-α of different cell lines by ELISA

圖5 Western blotting檢測穩(wěn)定細胞系中hNoc4L基因的表達Fig.5 Western blotting assay ofhNoc4Lgene in stable cell lines of RAW264.7. 1: pll3.7-EF1 in RAW264.7 cells; 2:pll3.7-EF1- hNoc4L-Flag in RAW264.7 cells.

3 討論

細胞生長和繁殖的快慢取決于細胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成的速率，而蛋白質(zhì)合成的速率又取決于核糖體的生成和核糖體RNA基因的轉(zhuǎn)錄速率，由此可知，核糖體的生物合成對細胞的生長有著決定性的作用。核糖體的生物合成是一個極其復(fù)雜的過程，在基因結(jié)構(gòu)水平上，核糖體RNA基因通常以多拷貝的形式存在于染色體上形成串聯(lián)重復(fù)單位序列，這些序列上還包含了一些重要的順式調(diào)控元件，配合著一些反式調(diào)控因子調(diào)控核糖體RNA基因的轉(zhuǎn)錄；在核糖體的大小亞基的成熟過程中，反式作用因子也發(fā)揮著重要的作用，如核酸酶對pre-rRNA非編碼序列的切除、SnoRNP對35S pre-RNA的假尿嘧啶化和甲基化修飾、RNA螺旋酶和RNA分子伴侶介導(dǎo)的RNP折疊和改構(gòu)、GTPase和 ATPase催化的蛋白質(zhì)的聚合和解聚合過程等[7,11-13]。在以酵母為模式生物對核糖體生物發(fā)生的調(diào)控機制進行研究的過程中不斷有新的發(fā)現(xiàn)。在釀酒酵母S. cerevisiae中，Noc類蛋白復(fù)合物是一類影響核糖體大小亞基裝配和核運輸?shù)闹匾姆词秸{(diào)控因子，但其在哺乳動物中的功能未知。因此研究Noc類蛋白在哺乳動物的核糖體生物合成中的作用是十分重要的，本實驗選擇了hNoc4L蛋白為研究對象。

在實驗研究中，常用的病毒載體有腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒載體等。腺病毒可以攜帶大DNA片段并能轉(zhuǎn)染多種細胞，但轉(zhuǎn)染效率較低，有較高的抗原性和毒性，只能短暫表達目的蛋白[14]；而慢病毒屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒的一種，基于 HIV-I型病毒構(gòu)建的慢病毒載體可以高效感染處于分裂期和非分裂期的細胞，能夠攜帶大片段基因，且不易誘發(fā)宿主免疫反應(yīng)，更重要的是能將目的基因高效整合到宿主細胞染色體中，不易引起插入突變，理論上能夠在細胞內(nèi)永久表達并在子代中穩(wěn)定表達[15]，而且改造后的慢病毒假病毒沒有復(fù)制能力，具有較好的生物安全性，是一種理想的基因轉(zhuǎn)移載體[16]。因此，本研究選擇慢病毒載體作為特異性表達hNoc4L基因的載體。

慢病毒載體的另一個優(yōu)點是有廣泛的細胞感染譜，為了檢測我們所獲得的重組慢病毒載體的感染效果，我們感染了不同來源的細胞株，發(fā)現(xiàn)其能高效感染來源于人、鼠、犬等不同物種的細胞系。MDCK細胞和Marc145細胞的常規(guī)轉(zhuǎn)染效率不高，約在5%～20%之間；而利用本實驗中構(gòu)建的載體，可以達到70%以上的陽性率，因此使用該載體可以方便地解決不易轉(zhuǎn)染的細胞系的外源基因難以高效導(dǎo)入的問題。

RAW264.7細胞是小鼠的巨噬細胞，當(dāng)有外界刺激時，該細胞極易分化，外形由正常狀態(tài)下的圓球形向不規(guī)則的形狀轉(zhuǎn)變，并且伴隨有炎癥因子的釋放，所以可以用來檢測我們所構(gòu)建的hNoc4L基因特異性表達載體的免疫原性。實驗數(shù)據(jù)表明，該載體通過感染進入細胞后，并沒有引起細胞形狀的改變，也沒有造成強烈的免疫反應(yīng)。此外，RAW264.7細胞也是一種極難利用常規(guī)化學(xué)試劑轉(zhuǎn)染的細胞，常用的方法就是電轉(zhuǎn)，而電轉(zhuǎn)是瞬時轉(zhuǎn)染，成本高，轉(zhuǎn)化后的細胞又容易分化。我們所獲得的hNoc4L基因特異性表達的載體因其帶有EGFP標簽，可以通過 FACS分選得到陽性細胞，又加之慢病毒載體可以通過本身具有的5′LTR和3′LTR穩(wěn)定整合到細胞基因組中并長期表達，因此免去使用抗生素篩選穩(wěn)定克隆所需的較長的時間周期。實驗結(jié)果也表明，我們所獲得的穩(wěn)定細胞系能夠長期穩(wěn)定表達hNoc4L基因。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建了hNoc4L基因特異性表達的重組慢病毒載體，該載體具有高效、長期穩(wěn)定表達和免疫原性低的特點，為后續(xù)研究hNoc4L蛋白在哺乳動物核糖體生物發(fā)生中的調(diào)控作用奠定了基礎(chǔ)。

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Construction and identification of recombinant lentiviral vector ofhNoc4Lgene

Tingting Wang1,2, Shujuan Wang3, and Jinghua Yan1

1CAS Key Laboratory of Pathogenic Microbiology and Immunology,Institute of Microbiology,Chinese Academy of Science,Beijing100101,China
2Graduate University of Chinese Academy of Sciences,Beijing100049,China
3China Animal Health and Epidemiology Center,Qingdao266032,China

Received:April 23, 2010;Accepted:May 11, 2010

Supported by:National Natural Science Foundation of China (No. 30870118).

Corresponding author:Jinghua Yan. Tel: +86-10-64807569; Fax: +86-10-64807598; E-mail: yanjh@im.ac.cn

國家自然科學(xué)基金項目 (No. 30870118) 資助。