白倩，張焱，汪音爵，羅堅，李巖，黃永東，馬潤宇，蘇志國

1 北京化工大學生命科學與技術學院，北京 100029

2 中國科學院過程工程研究所 生化工程國家重點實驗室，北京 100190

生物技術與方法

乳腺生物反應器表達的重組人乳鐵蛋白的分離純化及生物活性鑒定

白倩1,2，張焱2，汪音爵2，羅堅2，李巖2，黃永東2，馬潤宇1，蘇志國2

1 北京化工大學生命科學與技術學院，北京 100029

2 中國科學院過程工程研究所 生化工程國家重點實驗室，北京 100190

以國產(chǎn)高交聯(lián)度的快流速瓊脂糖為基質，合成了不同配基密度的 SP (Sulfopropyl，磺酸基) 離子交換介質，建立了乳腺生物反應器表達重組人乳鐵蛋白 (Recombinant Human Lactoferrin，rHLF) 的純化方法。以溶菌酶為模型蛋白考察了不同配基密度離子交換介質的靜態(tài)和動態(tài)吸附行為，結果表明介質具有良好的吸附性能。不同配基密度離子交換介質均可純化得到rHLF，其中，高配基密度 (0.24 mol/L) 的離子交換介質每毫升可以處理50 mL rHLF牛乳，rHLF收率為86.5%，純度為98.5%。圓二色譜的測定結果表明純化的rHLF二級結構與天然人乳鐵蛋白一致。生物學功能實驗結果表明，rHLF的鐵結合與釋放活性與天然人乳鐵蛋白相似，濃度為5 g/L的rHLF對大腸桿菌的生長具有明顯的抑制作用。

離子交換介質，配基密度，重組人乳鐵蛋白，純化，抑菌活性

Abstract:Novel ion exchange adsorbents were synthesized by immobilizing sulfopropyl derivative onto homemade highly cross-linked agarose beads. The effects of different ligand densities (from 0.05 to 0.24 mol/L) on static and dynamic adsorption of the adsorbents were investigated using lysozyme as a model protein. Based on these results, rHLF was purified from the transgenic milk by our SP media. 1 mL high density (0.24 mol/L) adsorbent could handle 50 mL rHLF-containing milk. The mass recovery of rHLF was 86.5% and the purity was 98.5%. CD spectra demonstrated that the native structure of rHLF was not affected in the purification process. The biological functions of the purified rHLF, including iron binding, releasing and antimicrobial activities were then investigated. The results showed that rHLF had comparable iron binding and releasing activity to that of native HLF. 5 g/L concentration of rHLF significantly inhibited the growth ofEscherichia coli. These studies lay a solid foundation for the wideapplication of our self-prepared ion exchange adsorbents in protein purification.

Keywords:ion exchange adsorbents, ligand density, recombinant human lactoferrin, purification, antimicrobial activity

乳鐵蛋白 (Lactoferrin，LF) 又名乳轉鐵蛋白，是轉鐵蛋白家族的重要一員。其分子量大約80 kDa[1]，等電點為8.7左右[2]。乳鐵蛋白分子中結合了兩條糖鏈，占分子量的7%左右。蛋白分子N端和C端的特征環(huán)狀結構可以結合三價鐵離子。乳鐵蛋白具有多種重要的生理功能，主要包括鐵吸收與釋放、抗菌活性以及炎癥反應中的鐵離子代謝等。人乳中乳鐵蛋白含量較高，但因人乳來源有限，嚴重限制了其商業(yè)化應用。隨著轉基因技術的突飛猛進，利用家畜乳腺生物反應器大規(guī)模生產(chǎn)人乳鐵蛋白已經(jīng)獲得成功[3]，從重組牛乳中純化所得的rHLF蛋白可以廣泛應用于醫(yī)藥及營養(yǎng)等領域。

離子交換層析技術適用范圍廣，洗脫條件溫和，已成為蛋白質分離純化中非常重要的一種手段，rHLF蛋白也可以通過陽離子交換層析進行有效純化[4-5]。但是蛋白質在層析過程中存在的一個主要問題是介質表面可能引起蛋白質結構的變化，造成蛋白質的失活[6-7]。其中介質表面的配基類型和密度對蛋白結構影響最大。比如 Karger小組[8-9]研究了疏水介質的配基類型對溶菌酶、胃蛋白酶、牛胰蛋白酶抑制劑等蛋白結構的影響，研究發(fā)現(xiàn)介質的疏水性越強，越易造成蛋白結構的變化。Fernandez小組[10]利用 H-D 結合核磁共振發(fā)現(xiàn) α-乳白蛋白(α-Lactalbumin) 在不同的疏水表面其結構變化的程度不同。Visser[11]和Eagle小組[12]利用圓二色光譜發(fā)現(xiàn)蛋白質在介質表面的吸附狀態(tài)類似于熔球態(tài)，盡管保留了大部分二級結構，但是失去了三級結構。黃永東等[13]在研究離子交換介質的配基密度對重組乙肝病毒表面抗原 (r-HBsAg) 的結構影響時發(fā)現(xiàn)介質配基密度越大，蛋白越容易變性。此外，目前用于純化 rHLF蛋白的商品化離子交換介質 SP Sepharose Fast Flow為GE Healthcare公司產(chǎn)品，其價格昂貴。而且在實際操作中所處理的物料為牛乳，其成分復雜，對離子交換介質的污染比較嚴重，所以使用周期有限。因此合成價低質優(yōu)的離子交換介質用于替代進口介質可以大幅度降低生產(chǎn)成本，解決對進口介質的長期依賴問題。

本研究在純化rHLF的過程中，研制開發(fā)了以國產(chǎn)高交聯(lián)度快流速瓊脂糖為基質、不同配基密度的適用于rHLF分離純化的SP離子交換介質。該介質吸附性能良好，合成工藝中配基密度可控，一方面可以有效地控制層析過程對rHLF結構的影響，從而得到具有正常生物活性的重組蛋白質；另一方面有效地降低rHLF的生產(chǎn)成本，有望替代目前工業(yè)生產(chǎn)廣泛使用的進口離子交換介質。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1轉基因牛乳凍干粉

由中國農(nóng)業(yè)大學農(nóng)業(yè)生物技術國家重點實驗室提供。

1.1.2陽離子交換介質

高交聯(lián)度快流速瓊脂糖 (QZT，6%瓊脂糖)由中國科學院過程工程研究所生化工程技術中心合成；SP Sepharose FF購自GE Healthcare公司(美國)。

1.1.3試劑

牛血清白蛋白 (Bovine Serum Albumin，BSA) 購自 Roche 公司 (德國)；溶菌酶 (Lysozyme，LYZ) 購自Merck 公司 (德國)；天然人乳鐵蛋白購自Sigma公司 (美國)；化學試劑均為國產(chǎn)分析純試劑；所用純水由Milli Q-plus超純水機制備 (Millipore，美國)。

1.1.4儀器

常壓層析系統(tǒng)：?KTA purifier購自 GE Healthcare 公司 (美國)；質譜儀：LCQ Deca xpplus購自Thermo公司 (美國)；電泳儀：Mini-PROTEAN Tetra System 購自 Bio-Rad公司 (美國)；高效凝膠過濾色譜儀：Agilent 1100購自Agilent公司 (美國)；圓二色光譜儀：Jasco810 購自 Jasco公司 (日本)；滅菌鍋：手提式壓力蒸汽消毒器購自江陰濱江醫(yī)療設備廠；超凈臺：YT-CJ-2ND型生物工作臺購自北京半導體設備廠。

1.2 介質合成及層析方法

1.2.1SP QZT FF 介質的合成

以國產(chǎn)的快流速瓊脂糖 (QZT，6%瓊脂糖) 為基質，經(jīng)活化，偶聯(lián)，收獲 3個步驟[14]合成了 SP瓊脂糖凝膠 (SP QZT FF)。通過改變活化劑烯丙基縮水甘油醚 (Allylglycidyl ether，AGE) 的用量，獲得不同配基密度的SP瓊脂糖凝膠，配基密度可以控制在 0.05～0.24 mol/L。(配基密度以介質中磺酸基的交換容量來表示)。

1.2.2SP QZT FF 介質的蛋白吸附性能

具體方法參見文獻[15]，所用緩沖液為20 mmol/L磷酸鹽緩沖液，實驗數(shù)據(jù)均為3次實驗的平均值。溶菌酶含量的測定采用紫外吸收法，溶菌酶消光系數(shù)為 2.63 L/(g·cm)[16]。

1.2.3層析方法

對于rHLF的層析實驗，取轉基因牛乳凍干粉，45℃水溶解后，4℃、12 000 r/min 離心30 min去除脂肪，即得脫脂乳。以1 mol/L HCl 調節(jié)pH至4.6，靜置20 min，4℃、12 000 r/min離心30 min，去除酪蛋白；再以1 mol/L NaOH調節(jié)pH至6.0，4℃、12 000 r/min 離心 10 min，上清即為牛乳乳清。合成的介質充分清洗后裝柱 (25 cm×10 mm I.D.，CV=5 mL)，用 0.5 mol/L NaOH 清洗5個柱床體積后，連接到常壓層析系統(tǒng)。使用 Buffer A (20 mmol/L PB，pH值隨具體實驗調整) 平衡后，乳清進樣若干，進樣完畢之后繼續(xù)使用Buffer A淋洗至UV基線，得到穿透峰p0，使用Buffer B (20 mmol/L PB，pH值和NaCl濃度隨具體實驗調整) 進行線性洗脫，洗脫梯度為0%～100% Buffer B，洗脫時間60 min，收集洗脫峰分別記為p1、p2、p3等，流速1 mL/min，紫外檢測波長280 nm。

1.3 鑒定檢測方法

1.3.1蛋白質濃度測定

蛋白質濃度參照Bradford法測定[17]，根據(jù)標準品BSA的標準曲線求得原料及各個洗脫峰中的蛋白質含量。

1.3.2質譜鑒定

送交中國科學院化學研究所質譜中心鑒定。

1.3.3高效凝膠過濾分析

凝膠過濾使用 Agilent 1100 層析系統(tǒng)和SuperdexTM75 (20 cm×10 mm，I.D.) 層析柱，緩沖液為 Buffer C (20 mmol/L PB+0.1 mol/L Na2SO4)，流速0.5 mL/min，進樣量 100 μL。

1.3.4SDS-PAGE 電泳分析

SDS-PAGE 電泳參照文獻[18]。濃縮膠的濃度為 5%，分離膠的濃度為 12%，電泳緩沖液采用Tris-甘氨酸系統(tǒng)。

1.3.5圓二色光譜 (CD) 分析

圓二色光譜儀為Jasco810 (Jasco，日本)。掃描波長為190～260 nm，分辨率為1 nm。用與待測樣品中溶液相同的體系作為空白，CD譜圖為3次測量結果的平均值。

1.3.6rHLF鐵離子結合與釋放活性

鐵離子結合活性：將凍干的重組乳鐵蛋白溶解到 FeNTA溶液 (10 mmol/L硝酸鐵，8.5 mmol/L NTA，用固體 NaHCO3調 pH至 7.0) 中，乳鐵蛋白與 Fe3+的摩爾比 1∶4，室溫下反應 1 h后用0.15 mol/L NaCl溶液透析。透析所得蛋白溶液使用分光光度計進行全波長掃描，掃描范圍260～700 nm。

鐵離子釋放活性：鐵飽和的重組人乳鐵蛋白分別在不同pH值 (pH 2.0～7.0) 的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液中透析平衡，使用分光光度計測量透析所得蛋白溶液在280 nm和465 nm處的吸收值。

1.3.7抗菌活性

用肉湯瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)大腸桿菌，挑單菌落至10 mL液體培養(yǎng)基中，200 r/min 培養(yǎng)5 h，溫度37℃。取100 μL菌液加入到10 mL終濃度分別為0.5、2、5 g/L的rHLF蛋白溶液中繼續(xù)培養(yǎng)，分別于 0、4、8、16、24 h的時候取出部分菌液測定其在 600 nm處的吸收值，陰性對照使用無菌水代替rHLF蛋白溶液，實驗重復3次。

2 結果與分析

2.1 自制介質蛋白吸附性能的考察

離子交換層析介質的吸附性能會影響分離純化的效率[19]。介質的吸附性能包括兩個方面：靜態(tài)吸附性能和動態(tài)吸附性能。靜態(tài)吸附平衡可以反映介質的吸附量，而介質的動態(tài)吸附行為與實際操作更為貼近，本研究首先采用溶菌酶作為模型蛋白質考察了不同配基密度介質的吸附性能，并與進口介質進行了比較。

2.1.1靜態(tài)吸附平衡

以溶菌酶為模型蛋白質考察了常溫25℃下自制介質的靜態(tài)吸附平衡。按照 Langmuir吸附等溫方程[20]的形式計算了自制介質吸附性能，結果見表1，隨著配基密度的增加，介質對蛋白的飽和吸附容量qm隨之增加，解離常數(shù)Kd隨之減小，其中qm相近的自制介質 (配基密度為 0.20 mol/L) 與進口介質相比，其Kd值低于進口介質，這種現(xiàn)象的優(yōu)點是使得此自制介質結合蛋白的能力增強，可以對在某些條件下帶電性較弱的蛋白形成有效吸附，雖然此介質也可能會在純化過程中引起蛋白質結構的變化，但是可以通過提高緩沖液的電導來避免這種現(xiàn)象的發(fā)生。此外，自制介質的最高配基密度可以達到0.24 mol/L，該介質的吸附容量高于進口介質的吸附容量。

表1 不同配基密度對溶菌酶吸附性能的影響Table 1 Effect of different ligand densities on the adsorption character of Lysozyme to SP QZT FF (25°C)

2.1.2動態(tài)吸附平衡

通常選用穿透曲線來評價介質的動態(tài)吸附性能，在沒有達到吸附飽和之前，層析柱流出液的蛋白濃度為零；當達到吸附飽和臨界點時，層析柱流出液的蛋白濃度突然上升并很快達到進樣料液的蛋白濃度，表現(xiàn)為一條非常陡峭的曲線，通常把峰高10%處稱為穿透點。圖1為流速為0.2 mL/min時，溶菌酶在不同配基密度自制SP QZT FF層析柱及進口SP Sepharose FF層析柱中的穿透曲線。

圖1 溶菌酶在不同配基密度自制SP QZT FF柱及進口SP Sepharose FF柱上的穿透液濃度隨層析過程的變化曲線Fig.1 Penetration profile of Lysozyme on SP Sepharose FF and self-prepared SP QZT FF with different ligand densities.C/C0:ratio of penetrating protein concentration to loading protein concentration;Volume/Column Volume: ratio of loading volume to column volume. The ligand densities of the adsorbents 1 to 5 were 0.05, 0.10, 0.15, 0.20 and 0.24 mol/L,respectively.

從結果可以看出，在流速為0.2 mL/min的條件下，隨著自制介質配基密度的增加，溶菌酶的穿透時間越來越晚，說明其動態(tài)載量越來越大。此外，吸附曲線為窄陡型，說明自制介質具有很好的動態(tài)吸附性能。其中高配基密度 (0.24 mol/L) 的自制介質穿透時間晚于進口介質，說明自制高配基密度介質的吸附容量高于進口介質，可以實現(xiàn)蛋白質的高容量分離，具有良好的應用前景。

2.2 重組人乳鐵蛋白的離子交換層析

影響離子交換層析的因素很多，包括層析介質、流動相、pH值、鹽濃度、蛋白質濃度等，這些因素之間的作用非常復雜。其中層析介質是純化過程的核心，介質的性能對于分離的效果起到?jīng)Q定性的作用。本實驗以重組人乳鐵蛋白為研究對象，考察了自制介質對蛋白的純化效果。通過優(yōu)化實驗選擇 Buffer A (20 mmol/L PB，pH 6.0) 和Buffer B (20 mmol/L PB+1 mol/L NaCl，pH 6.0) 作為流動相。乳清進料40 mL (蛋白濃度 6.75 g/L) 后用 Buffer A淋洗至UV基線，再以線性梯度洗脫并分別收集穿透峰和洗脫峰，實驗考察了不同配基密度介質對rHLF分離純化的層析效果，圖2是以高配基密度 (0.24 mol/L) 自制介質純化rHLF的層析譜圖，其他介質對rHLF的層析行為均相似。

圖2 自制離子交換介質分離rHLF層析譜圖Fig.2 Chromatogram of rHLF purified by self-prepared SP QZT FF. Column size: 25 cm×10 mm I.D., CV=5 mL; Buffer A:20 mmol/L PB, pH 6.0; Buffer B: 20 mmol/L PB+1 mol/L NaCl, pH 6.0; Loading volume: 40 mL; Flowing rate: 1 mL/min.The ligand density of the adsorbent was 0.24 mol/L.

對圖中p0、p1+p2、p3進行了SDS-PAGE分析，結果見圖3，自制介質純化得到的p3峰為高純度的重組乳鐵蛋白，p1和p2峰僅含有少量的重組乳鐵蛋白，穿透峰p0里無重組人乳鐵蛋白，分離效果令人滿意。本實驗又對p3峰進行了高效凝膠過濾分析 (HPSEC，High-Performance Size-Exclusion Chromatography，圖4)，結果表明自制介質純化得到的重組人乳鐵蛋白的純度達到95%以上，使用紫外積分計算回收率達到80%以上。

此外，我們考察了不同配基密度介質在分離轉基因牛乳過程中的處理量，并與進口介質進行了比較。在層析進樣過程中分段收集流出液，并使用HPSEC分析流出液組分，出現(xiàn)rHLF特征峰時對應的進樣體積即為最大處理量，結果見表2。隨著配基密度的增加，每毫升介質對轉基因牛乳的最大處理量逐漸增加，其中1 mL高配基密度介質 (0.24 mol/L)可以處理50 mL轉基因牛乳，高于進口介質的處理量，節(jié)省了純化工藝的上樣時間，可以實現(xiàn) rHLF高容量分離。

圖3 自制離子交換介質純化rHLF收集組分的SDS-PAGE電泳分析圖Fig.3 SDS-PAGE analysis of fractions collected from self-prepared SP QZT FF. M: molecular weight marker; 1: p0flowing through from self-prepared SP QZT FF; 2: whey extract of transgenic milk; 3: p1+p2eluted from self-prepared SP QZT FF; 4: p3eluted from self-prepared SP QZT FF; 5: HLF standard. The ligand density of the adsorbent was 0.24 mol/L.

圖4 自制離子交換介質層析洗脫峰p3的高效凝膠過濾圖Fig.4 HPSEC analysis of elution fraction p3from self-prepared SP QZT FF. The ligand density of the adsorbent was 0.24 mol/L.

表2 每毫升介質對轉基因牛乳的最大處理量Table 2 Maximal transgenic milk treatment volume by 1 mL adsorbent

2.3 純化的重組乳鐵蛋白的分子量測定

MALDI-TOF 的結果表明，我們純化得到的重組人乳鐵蛋白的分子量為79 481 Da (圖5)，由于人乳鐵蛋白單肽的理論分子量為76 304 Da，所以重組人乳鐵蛋白的糖鏈分子量應為3 177 Da。天然人乳鐵蛋白的分子量為82 000 Da左右，所以重組人乳鐵蛋白與天然人乳鐵蛋白的分子量相差2 000 Da左右，分子量的差異可能是牛乳腺表達的重組人乳鐵蛋白與天然人乳鐵蛋白的糖基化形式的差異造成的[3]。

圖5 rHLF分子量測定Fig.5 Determination of molecular weight of rHLF.

2.4 純化重組乳鐵蛋白的圓二色分析

為了評價自制介質對牛乳腺表達的重組人乳鐵蛋白結構的影響，我們使用圓二色譜比較了純化產(chǎn)品和天然人乳鐵蛋白的二級結構，結果如圖6所示，不同配基密度介質洗脫下來的rHLF均與天然HLF的圓二色譜曲線重合較好，說明離子交換層析中介質配基密度的高低不會造成 rHLF二級結構的不可逆變化，即我們自制介質的純化不會導致重組蛋白質的變性，有利于我們得到完整生物活性的重組蛋白。

2.5 純化重組人乳鐵蛋白的生化性質與生理功能的鑒定

重組表達蛋白質的研究往往存在一個問題，即重組蛋白生物活性喪失，或活性較低。表達過程中的蛋白一級序列的改變，或者蛋白折疊的錯誤，甚至糖基化、磷酸化的錯誤修飾都能導致重組蛋白活性的異常。人乳鐵蛋白轉基因研究的目的是生產(chǎn)大量具有正常生物活性、功能的重組人乳鐵蛋白。因此對重組蛋白的理化性質和生物活性的分析與鑒定就顯得尤為重要。本實驗考察了重組人乳鐵蛋白的活性，包括鐵離子結合能力和抑菌能力，來評估重組人乳鐵蛋白的生化性質與生理功能。

圖6 不同配基密度離子交換介質制備rHLF的圓二色譜圖Fig.6 Circular dichroism spectrum of rHLF desorbed from adsorbents with different ligand densities. The ligand densities of the adsorbents 1 to 5 were 0.05, 0.10, 0.15, 0.20 and 0.24 mol/L, respectively.

2.5.1鐵結合與釋放的結果

人乳鐵蛋白結合和釋放鐵離子的能力具有重要的生理意義。乳鐵蛋白在腸道中能夠識別并特異結合細胞表面的人乳鐵蛋白受體 (LF receptor，LFR)，從而進入細胞內(nèi)部釋放出 Fe3+，提供給細胞吸收利用。人乳鐵蛋白分子結合鐵離子之后空間結構會發(fā)生變化，465 nm處出現(xiàn)特征吸收峰[21]。實驗結果表明，重組人乳鐵蛋白在體外經(jīng)過鐵飽和處理后，在465 nm處也出現(xiàn)了明顯特征吸收峰 (圖7)，這說明重組人乳鐵蛋白同樣具備結合鐵離子的能力[22]。接下來，我們比較了重組人乳鐵蛋白和天然人乳鐵蛋白在不同 pH條件下鐵離子的結合能力。實驗結果(圖8) 表明，重組人乳鐵蛋白在不同pH條件下與鐵離子的結合能力不同，在中性或偏酸性的條件下，重組人乳鐵蛋白能夠有效結合鐵離子。當pH下降到4.5時，鐵離子開始解離；隨著pH的進一步降低到pH 2.5時，大部分鐵離子均從乳鐵蛋白中解離出來，這與天然人乳鐵蛋白的鐵結合與釋放活性基本一致。

圖7 未結合鐵與結合鐵的rHLF的掃描圖譜Fig.7 Full-wavelength-scan profile of iron free and binding rHLF.

圖8 rHLF在不同pH條件下鐵結合與釋放情況Fig.8 Profile of iron binding rHLF in different pH conditions.

2.5.2重組乳鐵蛋白抑菌活性分析

人乳鐵蛋白能特異結合細菌生長不可或缺的鐵離子[23]，并抑制細菌的生長。也有報道[24]認為人乳鐵蛋白能夠直接結合到細菌細胞壁的脂多糖上，改變細胞壁的滲透壓，使細菌的胞質外瀉而直接殺滅細菌。我們研究了重組人乳鐵蛋白在體外對大腸桿菌生長的抑制作用。結果表明，濃度為5 g/L的重組人乳鐵蛋白對大腸桿菌的生長具有明顯抑制作用(圖9)；當重組人乳鐵蛋白的濃度降低到2 g/L時，對細菌的生長的抑制作用下降；當重組人乳鐵蛋白的濃度進一步降低到0.5 g/L時，對細菌基本沒有抑制作用。這說明，重組人乳鐵蛋白的抑菌作用是劑量依賴的，只有達到一定的劑量，人乳鐵蛋白才會表現(xiàn)出明顯的抑菌效果。

圖9 rHLF對大腸桿菌生長的抑制活性Fig.9 Antibacterial effect of rHLF.

3 結論

本研究自主合成了不同配基密度的 SP離子交換介質，其中最高密度可以達到0.24 mol/L。以溶菌酶為模型蛋白的吸附實驗結果表明，層析介質的吸附容量隨配基密度的增加而升高，制備的最高配基密度介質的吸附容量高于進口介質，每毫升此介質可以處理50 mL重組人乳鐵蛋白牛乳。不同配基密度層析介質均具備良好的rHLF分離純化性能，其中最高配基密度介質純化rHLF收率為86.5%，純度為98.5%。通過層析實驗發(fā)現(xiàn)，本實驗范圍內(nèi)的不同配基密度SP離子交換介質不會對rHLF的二級結構造成不可逆的改變，純化所得的rHLF具有與天然人乳鐵蛋白一致的生物學活性，可以用于rHLF純化的規(guī)?；a(chǎn)。此外，自制介質成本低廉 (價格僅約為進口介質的1/3～1/2)，有效地降低了rHLF的生產(chǎn)成本，解決了目前國內(nèi)蛋白質純化長期依賴進口介質的問題。

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Purification and characterization of recombinant human lactoferrin expressed in a cattle mammary bioreactor

Qian Bai1,2, Yan Zhang2, Yinjue Wang2, Jian Luo2, Yan Li2, Yongdong Huang2, Runyu Ma1,and Zhiguo Su2

1College of Life Science and Technology,Beijing University of Chemical Technology,Beijing100029,China
2National Key Laboratory of Biochemical Engineering,Institute of Process Engineering,Chinese Academy of Sciences,Beijing100190,China

Received:February 1, 2010;Accepted:April 9, 2010

Supported by:National High Technology Research and Development Program of China (863 Program) (Nos. 2007AA100506, 2010AA100501),National Nature Science Foundation of China (No. 20706052).

Corresponding author:Jian Luo. Tel/Fax: +86-10-82627062; E-mail: jluo@home.ipe.ac.cn

國家高技術研究發(fā)展計劃 (863計劃) (Nos. 2007AA100506, 2010AA100501)，國家自然科學基金 (No. 20706052) 資助。