賈瓊 石大偉 趙玉玲 李輝 陳彥丞 李亮 朱國(guó)峰

(1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院/北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)研究所 北京 100176;2.河南省疾病預(yù)防控制中心 鄭州 450016;3.國(guó)家科學(xué)技術(shù)部辦公廳 北京 100862;4.北京結(jié)核病胸部腫瘤研究所 北京 101149)

鏈霉素是第一個(gè)用于治療結(jié)核病的藥物[1]。由于用于治療結(jié)核病歷史較長(zhǎng),鏈霉素耐藥在全球較為嚴(yán)重。在我國(guó)鏈霉素的耐藥率為20.5%,在4種常用一線抗結(jié)核藥物的耐藥率中最高[2]。雖然鏈霉素的高耐藥率及其耳毒性限制了該藥在治療耐多藥結(jié)核中的應(yīng)用,但是在按階梯原則使用注射類抗結(jié)核藥時(shí)鏈霉素仍是首選[3]。因此,使用分子生物學(xué)技術(shù)早期快速檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌的鏈霉素耐藥性對(duì)于及時(shí)制定和調(diào)整耐多藥(MDR)結(jié)核病的治療方案具有重要意義。結(jié)核分枝桿菌rpsL和rrs基因的突變與鏈霉素耐藥有關(guān),但多數(shù)研究[1,4-6]顯示檢測(cè)此2個(gè)基因突變最多可發(fā)現(xiàn)80%左右的鏈霉素耐藥菌株。本研究通過(guò)對(duì)來(lái)自于河南省的較大樣本的耐多藥結(jié)核分枝桿菌的鏈霉素相關(guān)基因rpsL的編碼區(qū)全長(zhǎng)和rrs高頻突變區(qū)中的突變進(jìn)行分析,力圖為開發(fā)和應(yīng)用適合該地區(qū)乃至更大范圍的快速檢測(cè)耐多藥結(jié)核分枝桿菌鏈霉素耐藥性的分子診斷工具提供更多的數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 菌株來(lái)源 115株耐多藥結(jié)核分枝桿菌株來(lái)源于河南省疾病預(yù)防控制中心,分離培養(yǎng)自2007至2009年河南省結(jié)核病患者(包括新發(fā)和復(fù)發(fā)患者,男82例,女33例,年齡15到86歲)的痰標(biāo)本。另收集了22株對(duì)利福平、異煙肼、乙胺丁醇和鏈霉素全敏感菌株作為對(duì)照。

1.2 菌株的分離培養(yǎng)、菌種鑒定和藥物敏感性實(shí)驗(yàn)菌株分離培養(yǎng)、菌種鑒定按照中國(guó)防癆協(xié)會(huì)2006年修訂并出版的《結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》中推薦的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行。藥敏實(shí)驗(yàn)為WHO推薦的比例法。

1.3 結(jié)核分枝桿菌基因組DNA提取和rpsL、rrs基因的PCR擴(kuò)增和測(cè)序 采用煮沸法提取結(jié)核分枝桿菌基因組DNA。使用Phusion熱啟動(dòng)高保真DNA聚合酶擴(kuò)增rpsL、rrs基因全長(zhǎng)序列。PCR擴(kuò)增和測(cè)序所用引物序列見表1。測(cè)序工作由北京諾賽基因組研究中心有限公司完成。

1.4 測(cè)序數(shù)據(jù)分析和統(tǒng)計(jì)分析 分別使用軟件Seqman pro(version 7.1,DNAstar Lasergene,Inc.,USA)和SPSS for windows(version 10.0,SPSS,Inc.,USA)進(jìn)行測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。參比序列為結(jié)核分枝桿菌H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株DNA序列。

2 結(jié)果

115株耐多藥(MDR)結(jié)核分枝桿菌株中有114株獲得良好的擴(kuò)增產(chǎn)物和測(cè)序數(shù)據(jù)。114株中99株為鏈霉素耐藥,15株為鏈霉素敏感。

表1 rpsL和rrs基因PCR擴(kuò)增和測(cè)序相關(guān)信息

表2 鏈霉素耐藥相關(guān)基因rpsL和rrs突變特征(按突變位點(diǎn)分析)

在完成分析的114株 MDR結(jié)核分枝桿菌的rpsL和rrs基因中,共檢測(cè)到10個(gè)突變位點(diǎn)(以密碼子編號(hào)計(jì)算),詳見表2。其中同義突變?yōu)閞psL39(1株)和rpsL121(114株)。在結(jié)核分枝桿菌耐藥相關(guān)基因突變和多態(tài)性數(shù)據(jù)庫(kù)(www.tbdreamdb.com)中檢索發(fā)現(xiàn)的10個(gè)突變位點(diǎn),有4個(gè)突變位點(diǎn)未見記錄：非同義突變 rpsL2(1株)、rrs1443(1株)和同義突變r(jià)psL39、rpsL121。所有MDR菌株和22株全敏感菌株均發(fā)生rpsL121位突變,檢索TBDB數(shù)據(jù)庫(kù)(www.tbdb.org)顯示 rpsL 121位AAA→AAG為多態(tài)性改變,與鏈霉素耐藥性無(wú)關(guān)。

rpsL和rrs基因的突變類型均為點(diǎn)突變,未發(fā)現(xiàn)插入或缺失。rpsL 43位點(diǎn)的突變類型有兩種：AAG→ACG(1株)和AAG→AGG(62株),主要為AAG→AGG(K43R),均為密碼子第二個(gè)堿基的突變。rpsL 88位點(diǎn)的突變類型為：AAG→ACG(2株)、AAG→AGG(11株)、AAG →ATG(1株)。rrs基因的各突變位點(diǎn)只發(fā)現(xiàn)一種突變類型(表2)。

除去僅發(fā)生同義突變和多態(tài)性位點(diǎn)的菌株,共有80.7%(92/114)的MDR結(jié)核分枝桿菌的 rpsL和rrs基因發(fā)生突變(發(fā)生1個(gè)及1個(gè)以上位點(diǎn)突變的菌株)。不考慮單點(diǎn)同義突變和多態(tài)性位點(diǎn),發(fā)生rpsL 43突變的菌株比例最高,為55.3%;其次是rpsL 88,為 12.3%;再次是 rrs1440,為 9.6%,但其中10株為合并rpsL 43突變。發(fā)生rrs513突變的菌株有10株,其中有9株是 rrs基因單點(diǎn)突變;發(fā)生rrs516突變的菌株有4株,均為rrs基因單點(diǎn)突變(表2)。

單獨(dú)檢測(cè)rpsL基因突變可以發(fā)現(xiàn)74.7%對(duì)鏈霉素耐藥的MDR菌株,加入rrs基因后靈敏度提高至 88.9%(88/99)。有 63株 MDR菌株發(fā)生rpsL43突變,但這些菌株中有3株是鏈霉素敏感菌株,另有1株鏈霉素敏感的MDR菌株發(fā)生 rrs513突變。

3 討論

本研究中rpsL基因的突變主要發(fā)生在rpsL43和 rpsL88,rpsL43的主要突變類型為 AAG→AGG,其次是AAG→ACG,但后者只有1株發(fā)生該突變,這與已有研究的結(jié)果一致[4,7-8]。雖發(fā)現(xiàn)2個(gè)新突變位點(diǎn)(rpsL2和 rrs1443),但各只有1株,且與rpsL43突變同時(shí)發(fā)生,其在鏈霉素耐藥產(chǎn)生中的作用需要進(jìn)一步研究。

99株鏈霉素耐藥株中有74株發(fā)生 rpsL43或rpsL88突變,即 rpsL基因突變可解釋74.7%的MDR菌株的鏈霉素耐藥性,這個(gè)比例略高于某些研究的結(jié)果,但與中國(guó)中部的研究相近(76.5%)[4]。本研究中,rpsL和rrs基因突變總共可以解釋88.9%的MDR菌株鏈霉素耐藥,同樣高于某些研究的結(jié)果：美洲(56%～68%)[9],德國(guó)(48%)[10],和日本(77.8%)[6],但與中國(guó)中部的研究接近(85.2%)[4]。鏈霉素耐藥株的 rpsL和rrs基因的高突變頻率提示在河南地區(qū)通過(guò)檢測(cè)上述位點(diǎn)預(yù)測(cè)鏈霉素耐藥性有較高的潛在應(yīng)用價(jià)值。

rpsL 43突變菌株被認(rèn)為多數(shù)為鏈霉素高水平耐藥[1],但在本研究中發(fā)現(xiàn)有3株鏈霉素敏感菌株發(fā)生了 rpsL 43突變。此外還有1株敏感株發(fā)生rrs513突變。這些敏感株發(fā)生的突變降低了檢測(cè)的特異度。國(guó)內(nèi)也有研究報(bào)道[11-12]少數(shù)鏈霉素敏感株也發(fā)生rpsL和rrs基因突變的現(xiàn)象,但多被認(rèn)為是突變檢測(cè)或耐藥性檢測(cè)的誤差導(dǎo)致。我們認(rèn)為,這種現(xiàn)象與對(duì)乙胺丁醇敏感的MDR菌株中發(fā)生embB306突變相似[13-14],其原因可能與菌株對(duì)利福平或/和異煙肼耐藥有關(guān)。這4株結(jié)核分枝桿菌均為乙胺丁醇敏感,因此突變與乙胺丁醇耐藥有關(guān)的可能性不大。另一方面,鑒于所檢測(cè)樣品為均為MDR菌株,其中部分菌株很可能具有對(duì)二線藥的耐藥性,且已有研究表明 rrs突變和二線藥物卡那霉素的耐藥有關(guān)[15],因此不能排除上述4株鏈霉素敏感菌株的突變和菌株對(duì)二線藥物的耐藥有關(guān)。我們將檢測(cè)上述鏈霉素敏感菌株對(duì)卡那霉素、阿米卡星等藥物的耐藥性并進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量以驗(yàn)證鏈霉素敏感菌株發(fā)生rpsL和rrs基因突變現(xiàn)象的普遍性。

本研究中約有11%的鏈霉素耐藥菌株沒有發(fā)生rpsL和rrs基因的突變,有研究這指出這些菌株的耐藥性較低而使藥物敏感實(shí)驗(yàn)檢測(cè)時(shí)易于出現(xiàn)誤差[16],其耐藥機(jī)制也可能是細(xì)胞膜通透性的改變,但也不能排除還存在鏈霉素耐藥的其他機(jī)制。有研究報(bào)道gidB基因和鏈霉素耐藥有關(guān),[17],但有研究指出該基因突變?cè)诿舾芯暌矔?huì)出現(xiàn)[18]。因此,鏈霉素耐藥的分子機(jī)制及耐藥分子指標(biāo)還需深入研究以進(jìn)一步闡明。

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