吳園 胡頻頻 王易偉 李秀全 毛旭虎 鐘敏,4

(1.解放軍第二五四醫(yī)院檢驗(yàn)科 天津 300142;2.第三軍醫(yī)大學(xué)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)系臨床微生物及免疫學(xué)教研室暨重慶市生物制藥工程技術(shù)研究中心 重慶 400038;3.重慶市結(jié)核基因診斷中心實(shí)驗(yàn)室 重慶 400020;4.重慶市公共衛(wèi)生醫(yī)療救治中心 重慶 400036)

結(jié)核分枝桿菌存在一種特殊的生長(zhǎng)狀態(tài)—依賴?yán)Ｆ?R)生長(zhǎng)即依賴?yán)Ｆ浇Y(jié)核分枝桿菌(依R菌)在適宜的R濃度下生長(zhǎng)旺盛,無(wú)R生長(zhǎng)不良或不能生長(zhǎng)。依R菌感染所致肺結(jié)核患者具有病情重、耐多藥(74.4%～100%)、化療效果差和預(yù)后不良的臨床特征,比一般的耐藥病例危害更大。該類結(jié)核病如果再使用利福平,不但會(huì)導(dǎo)致化療失敗,而且可使病情惡化,是難治性結(jié)核病的產(chǎn)生和化療失敗的重要原因之一[1]。

在對(duì)依R菌的研究中發(fā)現(xiàn)：結(jié)核分枝桿菌假設(shè)蛋白R(shí)v0341的高表達(dá)與依 R菌結(jié)核病密切相關(guān),可視為依R菌的相關(guān)蛋白或標(biāo)志物,可用于診斷依賴?yán)Ｆ浇Y(jié)核分枝桿菌結(jié)核病(其蛋白2009年6月已獲得國(guó)家發(fā)明專利,專利號(hào)：200510057486.3)。

該研究擬通過(guò)對(duì)結(jié)核分枝桿菌假設(shè)蛋白R(shí)v0341編碼基因iniB限制性片段長(zhǎng)度的多態(tài)性分析,確認(rèn)基因的保守性,為依R菌結(jié)核病臨床血清學(xué)快速診斷和試劑盒的研發(fā)奠定基礎(chǔ),并探討依R菌在利福平培養(yǎng)管中Rv0341高表達(dá)的可能原因,為闡明依R菌的產(chǎn)生機(jī)制及依R菌結(jié)核病的有效防治提供幫助。

1 資料和方法

1.1 材料 依 R菌(14株)、耐 R菌(23株)、R敏感的結(jié)核分枝桿菌(12株)、結(jié)核分枝桿菌H37Rv、BCG及大腸埃希菌等滅活菌株,由重慶市結(jié)核基因診斷中心實(shí)驗(yàn)室提供;LA-Taq with GC Buffer DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶ApaⅠ、EcoRⅤ、KpnⅠ、SmaⅠ為 TAKARA公司產(chǎn)品;細(xì)菌基因組DNA基因組提取試劑盒(離心柱型)為天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品;核酸回收試劑盒為OMEGA公司產(chǎn)品;DNA MakerⅦ、100 bp DNA Maker為北京天為時(shí)代科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌基因組DNA提取大腸埃希菌、51株結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)物經(jīng)巴氏水浴1 h以上,無(wú)菌刮取培養(yǎng)物于高壓滅菌的EP管中,提取方法參照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書。

1.2.2 iniB基因的擴(kuò)增 用軟件Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)引物(引物由上海生工合成)：上游引物5′-ATGACCTCGCT TATCGATTAC-3′;下 游 引 物5′-TCAGAACCCGGGTAGTCCGAAAA-3′。 PCR反應(yīng)體系：LA-Taq with GC Buffer DNA聚合酶0.25 μ l,GC rich BufferⅠ 12.5 μ l,dNTP 4 μ l,上下游引物各 0.5 μ l,DNA 模板 4 μ l,雙蒸水 3.25 μ l。PCR反應(yīng)條件如下：94℃預(yù)變性5 min;94℃50 s,55℃45 s,72℃1 min 30 s,30個(gè)循環(huán);最后72℃延伸10 min。回收PCR產(chǎn)物中1440 bp大小的目的片段,操作參照核酸回收試劑盒說(shuō)明書。

1.2.3 iniB基因的測(cè)序隨機(jī)抽取20個(gè)目的片段送上海英駿生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

1.3 RFLP分析 對(duì)目的片段分別進(jìn)行2組雙酶切：(1)ApaⅠ和EcoRⅤ雙酶切反應(yīng)體系：PCR產(chǎn)物 4 μ l,Apa Ⅰ 0.5 μ l,10 ×L Buffer 1 μ l,補(bǔ)雙蒸水至10 μ l,37℃酶切 1 h,之后 65℃滅活 ApaⅠ20 min,在體系中繼續(xù)加入10×H Buffer 1μ l,EcoRⅤ 0.5μ l,補(bǔ)雙蒸水至20 μ l,37 ℃酶切1 h;(2)KpnⅠ和SmaⅠ雙酶切反應(yīng)體系：PCR產(chǎn)物5μ l,限制性內(nèi)切酶均為 0.7 μ l,10 ×T Buffer 1 μ l,BSA 1 μ l,補(bǔ)雙蒸水至10 μ l,37℃酶切1 h。酶切后1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其帶型。

2 結(jié)果

2.1 限制性內(nèi)切酶對(duì)目的片段的酶切分析 ApaⅠ 、EcoRⅤ、KpnⅠ 、SmaⅠ在iniB 基因上的酶切位置見表1。目的片段經(jīng)2組雙酶切均表現(xiàn)出相同的帶型,電泳圖譜見圖1、2,iniB基因在51株對(duì)利福平不同表型結(jié)核分枝桿菌中未發(fā)現(xiàn)多態(tài)性。

表1 iniB基因酶切片段

2.2 iniB基因測(cè)序結(jié)果 大腸埃希菌陰性對(duì)照無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物,50株結(jié)核分枝桿菌及BCG經(jīng)PCR得到長(zhǎng)度為1440 bp的iniB基因,與預(yù)期大小相符。隨機(jī)抽取20個(gè)目的片段送上海英俊生物技術(shù)有限公司測(cè)序,包括依R菌9株,耐R菌6株,R敏感菌5株,測(cè)序結(jié)果18株與GeneBank公布的序列完全一致,1株R敏感菌在第703位發(fā)生堿基突變,由C突變?yōu)門,1株依R菌在第1 399位發(fā)生堿基突變,由G突變?yōu)锳,氨基酸序列未發(fā)生突變。

3 討論

日本Nakamura等[2]報(bào)道了1例依R菌感染病例。自1999年全國(guó)耐藥結(jié)核病學(xué)術(shù)研討會(huì)上國(guó)內(nèi)首次提出結(jié)核分枝桿菌依賴?yán)Ｆ降默F(xiàn)象[3]以來(lái),國(guó)內(nèi)各地依 R結(jié)核桿菌發(fā)生率為7.3～17.1%[4-9]。按我國(guó)目前有活動(dòng)性肺結(jié)核患者450萬(wàn)計(jì)算[10],依R菌結(jié)核病患約有33～76萬(wàn)。臨床依R菌肺結(jié)核患者具有病情重,耐多藥,病程延長(zhǎng),化療效果差和預(yù)后不良的臨床特征[11-13],這是結(jié)核病防治領(lǐng)域一個(gè)新的問(wèn)題。

對(duì)依R菌在有R和無(wú)R 2種生長(zhǎng)條件下的研究中發(fā)現(xiàn)[14-18]：依R菌的形態(tài)、結(jié)構(gòu)、染色性、毒力和蛋白質(zhì)表達(dá)等方面均有明顯差異。比較依R菌在有R和無(wú) R兩種生長(zhǎng)條件下的蛋白圖譜,發(fā)現(xiàn)84%的依R菌在含R管中結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv假設(shè)蛋白R(shí)v0341表達(dá)量明顯增加;86%的非依R菌和H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株在含R管和無(wú)R對(duì)照管均沒(méi)有Rv0341的高表達(dá)。提示：結(jié)核分枝桿菌假設(shè)蛋白R(shí)v0341的高表達(dá)與依 R菌結(jié)核病密切相關(guān)[19]。

基于依R菌和非依R菌在蛋白R(shí)v0341表達(dá)方面的差異,本試驗(yàn)針對(duì)Rv0341編碼基因iniB進(jìn)行了限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析,發(fā)現(xiàn)其酶切后與結(jié)核標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv、BCG的酶切圖譜相同,在依R菌、耐R菌及R敏感結(jié)核桿菌中不具有多態(tài)性,是相對(duì)保守的基因,測(cè)序結(jié)果也證實(shí)了不同表型結(jié)核桿菌的iniB無(wú)突變。

綜上分析提示：結(jié)核分枝桿菌在蛋白 Rv0341表達(dá)方面的差異可能是RNA轉(zhuǎn)錄差異或利福平誘導(dǎo)的結(jié)果。

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