張春芳，客蕊，汪洋，王巖，郭玉紅

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)是一種慢性進(jìn)行性的自身免疫性疾病。以關(guān)節(jié)滑膜炎及對(duì)稱性、破壞性的關(guān)節(jié)病變?yōu)橹饕卣?。其病因及發(fā)病機(jī)制仍不清楚，但細(xì)胞因子已被公認(rèn)是RA炎癥和關(guān)節(jié)損傷的重要介質(zhì)，其主要的病理環(huán)節(jié)涉及免疫功能失常、關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞聚積與滑膜增厚、關(guān)節(jié)軟骨和骨破壞三個(gè)方面。本課題前期研究結(jié)果表明，三痹湯能降低佐劑型關(guān)節(jié)炎(AA)大鼠血清中TNF-α及IL-1表達(dá)水平，對(duì)關(guān)節(jié)炎癥進(jìn)展有一定的抑制作用。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步觀察三痹湯對(duì)AA大鼠膝關(guān)節(jié)及滑膜組織內(nèi)的病理變化及關(guān)節(jié)滑膜組織內(nèi)MMP-3、明膠酶-B表達(dá)的影響，結(jié)合前期研究結(jié)果，闡明三痹湯對(duì)AA大鼠膝關(guān)節(jié)及滑膜組織內(nèi)類風(fēng)濕因子的調(diào)控機(jī)制，以期為臨床三痹湯防治RA提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性Wistar大鼠60只，6～8周齡，體重(180±20)g，均購(gòu)自于由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，在通風(fēng)、溫度及濕度適宜的動(dòng)物室內(nèi)常規(guī)飼養(yǎng)。

1.1.2 藥品與試劑 川續(xù)斷、杜仲、防風(fēng)、華陰細(xì)辛等16味中藥材均購(gòu)自于黑龍江省藥材公司;雷公藤多苷片(上海醫(yī)科大學(xué)紅旗制藥廠，批號(hào):20070602，10mg/片);注射用卡介苗(上海生物制品研究所，批號(hào)20061103，75mg/支);MMP-3、明膠酶-B 試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備

YS100光學(xué)顯微鏡(日本OLYMPUS公司);展片儀、烤片機(jī)(中國(guó)天津愛華公司);RM2135超薄切片機(jī)德國(guó)(LEICA VLTRACUT公司);CMIA系列-多功能真彩色病理圖像分析系統(tǒng)(北京航空航天大學(xué)圖像中心);MK2500型足容積測(cè)量?jī)x(日本Mukomachi Kiai CD公司)。

1.2 方法

1.2.1 藥物的制備

三痹湯混懸液制備:川續(xù)斷、杜仲、防風(fēng)、華陰細(xì)辛等16味中藥材3倍量的水浸泡1h后，加熱煎煮2次，第1次煎3h，第2次煎2h，2次煎煮液混合后，80℃水浴濃縮成膏，60℃干燥箱中烘干成粉末，每克粉末含生藥3.52g。將中藥粉末加蒸餾水定期配制成混懸液，濃度為20%。

雷公藤混懸液:將雷公藤多苷片研成細(xì)末，加生理鹽水，配制成混懸液(每ml含雷公藤多苷1mg)。

弗氏完全佐劑(FCA):取凍干卡介苗50mg 80℃、1h滅活后，混入高壓滅菌的液體石蠟、羊毛脂(1∶1)12.5mL，配成10g·L-1的乳劑，充分碾磨、混勻即得。

1.2.2 模型制備與分組

將60只大鼠隨機(jī)分為5組:空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、三痹湯高劑量組、三痹湯中劑量組、雷公藤(TPT)對(duì)照組，每組12只。大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎(AA)的模型制備:臨用前從冰箱取出弗氏完全佐劑，充分振蕩、混勻。大鼠常規(guī)消毒后將其右后肢拉直，用1mL注射器針頭于足拓中部皮內(nèi)注射，每只大鼠注射0.1mL弗氏完全佐劑。除空白對(duì)照組外，其余四組均制備AA模型，所有動(dòng)物均造模成功［1］。

1.2.3 給藥方法

按人、大鼠給藥劑量體表面積折算公式計(jì)算出給藥計(jì)量。造模后第8天灌胃給藥，三痹湯高劑量組灌服中藥混懸液3.46g·(kg·d)-1，三痹湯中劑量組灌服中藥混懸液1.73g·(kg·d)-1，雷公藤組灌服雷公藤混懸液9.45mg·(kg·d)-1，模型組和空白組灌服同體積的蒸餾水。連續(xù)給藥21d。

1.2.4 足跖腫脹度的計(jì)算

分別于致炎前、給藥前、末次給藥后1h用足容積測(cè)量?jī)x測(cè)量各組大鼠、左、右后足容積。

1.2.5 光鏡觀察關(guān)節(jié)病理變化

造模21天后處死大鼠，取雙側(cè)踝關(guān)節(jié)，4%多聚甲醛固定1周，10%EDTA脫鈣1周，常規(guī)脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，HE常規(guī)染色。于光學(xué)顯微鏡下觀察病理形態(tài)學(xué)改變。

1.2.6 免疫組化檢測(cè)關(guān)節(jié)滑膜MMP-3、明膠酶-B的表達(dá)

①石蠟切片脫蠟至水化，3%H2O2室溫孵育5min以滅活內(nèi)源性酶，蒸餾水洗3次，熱修復(fù)抗原后PBS(0.01md·L-1pH 7.4)洗2次，每次5min;②10%的正常山羊血清封閉，室溫下孵育10min，PBS沖洗5min;③加1∶200稀釋的一抗，37℃孵育1～2h，PBS沖洗3次，每次5min;④滴加生物素標(biāo)記的二抗，室溫下孵育10min，PBS沖洗3次，每次5min;⑤滴加堿性磷酸酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，37℃孵育60min;PBS沖洗3次，每次5min;⑥D(zhuǎn)AB染色，蘇木素復(fù)染，脫水、透明、封片，顯微鏡下觀察。

圖像分析:隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野(×200)，計(jì)算每個(gè)視野的陽(yáng)性面積比，取其平均值。陽(yáng)性面積比為每個(gè)視野陽(yáng)性目標(biāo)面積占整個(gè)統(tǒng)計(jì)面積的百分率。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 光鏡觀察關(guān)節(jié)病理變化

空白組大鼠可見滑膜組織無(wú)增生及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，無(wú)血管翳形成，骨及軟骨結(jié)構(gòu)基本正常。模型組大鼠可見滑膜組織增生，細(xì)胞明顯充血水腫、呈不規(guī)則排列，大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，關(guān)節(jié)軟骨表面粗糙，骨部分破壞，血管翳形成并部分伸向關(guān)節(jié)腔，關(guān)節(jié)腔隙明顯縮小。雷公藤多甙組可見大鼠少量滑膜組織增生，細(xì)胞充血不明顯，排列較規(guī)則，散見炎細(xì)胞浸潤(rùn)，關(guān)節(jié)軟骨面較完整，局部粗糙，血管翳形成，關(guān)節(jié)腔隙稍縮小。三痹湯高劑量組由2～3層滑膜細(xì)胞構(gòu)成，細(xì)胞排列較整齊，仍可見少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，關(guān)節(jié)軟骨及骨變化與雷公藤多甙組相當(dāng)。三痹湯中劑量組可見滑膜組織輕度增生，部分細(xì)胞排列尚規(guī)整，踝關(guān)節(jié)和滑膜組織中炎性細(xì)胞明顯減少，關(guān)節(jié)軟骨破壞程度降低，關(guān)節(jié)腔隙輕度縮小，改善程度劣于高劑量組。

2.2 三痹湯對(duì)AA大鼠足跖腫脹度的影響

表1結(jié)果顯示，致炎后給藥前，與空白對(duì)照組相比，模型對(duì)照組、三痹湯高、中劑量組、TPT組大鼠左、右后足跖腫脹度明顯增高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);與本組給藥前相比，三痹湯高、中劑量組左、右后足跖腫脹度及TPT組右后足跖腫脹度明顯減輕，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。與給藥后模型對(duì)照組比較，三痹湯高、中劑量組及TPT組大鼠左、右足跖腫脹度明顯減輕，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，與TPT組相比，三痹湯組高、中劑量組左、右足跖腫脹度無(wú)明顯變化，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

表1 各組對(duì)AA大鼠足趾腫脹度影響的比較(±s)

表1 各組對(duì)AA大鼠足趾腫脹度影響的比較(±s)

注:與本組給藥前比較，△P＜0.05;與模型對(duì)照組給藥后比較，*P＜0.05;與空白對(duì)照組比較，#P＜0.05。

組別n 左后足跖腫脹度 右后足跖腫脹度給藥前(%) 給藥后(%) 給藥前(%) 給藥后(%)空白對(duì)照組15 2.31±0.13 2.53±0.21 2.42 ±0.18 2.75 ±0.19模型對(duì)照組 15 7.55±1.07# 8.47±1.15 31.91 ±4.90# 28.59±3.71三痹湯高組 15 7.46±2.00# 6.77±1.90△* 31.78 ±6.10# 18.57±4.26△*三痹湯中組 15 7.61±1.13# 6.82±1.01△* 32.65±5.03# 19.66±3.28△*TPT組 15 7.50±1.60# 6.50±0.97* 31.86 ±5.70# 17.05±3.50△*

2.3 三痹湯對(duì)AA大鼠關(guān)節(jié)滑膜MMP-3的表達(dá)的影響 見表2。

表2 各組對(duì)AA大鼠滑膜組織MMP-3影響的比較(±s)

表2 各組對(duì)AA大鼠滑膜組織MMP-3影響的比較(±s)

注:空白組比較，★P＜0.01;與模型組比較，△P＜0.05;與TPT組比較，*P ＜0.05，#P ＞0.05。

組別 n MMP-3陽(yáng)性面積比空白對(duì)照組15 7.72±0.78模型對(duì)照組 15 14.74±3.08★三痹湯高組 15 10.77 ±2.11△#三痹湯中組 15 11.82 ±1.87△*TPT組 15 9.50 ±1.97△

由表2可見，與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠滑膜組織中MMP-3呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);與模型組比較，三痹湯各組、TPT組能下調(diào)AA大鼠滑膜組織MMP-3的表達(dá)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);與TPT組比較，三痹湯高劑量組下調(diào)AA大鼠滑膜組織MMP-3的表達(dá)程度相當(dāng)，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，三痹湯低劑量組下調(diào)的程度減低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);提示三痹湯高、中劑量組均能降低AA鼠滑膜組織中MMP-3的表達(dá)，其中高劑量組作用較強(qiáng)。

2.4 三痹湯對(duì)AA大鼠關(guān)節(jié)明膠酶-B的表達(dá)的影響 見表3。

表3 各組對(duì)AA大鼠滑膜組織明膠酶-B影響的比較(±s)

表3 各組對(duì)AA大鼠滑膜組織明膠酶-B影響的比較(±s)

注:與空白組比較，★P＜0.01;與模型組比較，△P＜0.05;與TPT組比較，*P ＜0.05，#P ＞0.05。

組別 n MMP-3陽(yáng)性面積比空白對(duì)照組15 17.36±3.76模型對(duì)照組 15 59.70±6.53★三痹湯高組 15 27.73 ±4.53△#三痹湯中組 15 33.92 ±5.36△*TPT組 15 23.50 ±3.97△

3 討論

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)是一種以關(guān)節(jié)滑膜炎癥為主要病理表現(xiàn)的慢性、系統(tǒng)性的自身免疫性關(guān)節(jié)炎疾病。其重要的病理變化為滑膜組織過(guò)度增生、關(guān)節(jié)軟骨和骨組織進(jìn)行性破壞及功能障礙。近年研究發(fā)現(xiàn)，基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)的異常表達(dá)，可以直接降解軟骨和骨質(zhì)，引起關(guān)節(jié)軟骨及骨的損傷，從而對(duì)關(guān)節(jié)造成破壞，參與了 RA 的發(fā)病［2，3］。MMP-3 被認(rèn)為是導(dǎo)致軟骨降解的最重要的蛋白酶［4］。許多信息激活MMP-3后才能活化其它MMPs，是RA關(guān)節(jié)損傷的主要介質(zhì)，通過(guò)降解Ⅳ型膠原、纖維連接蛋白、層粘連蛋白等，引起骨組織的破壞［5，6］。RA患者關(guān)節(jié)滑液及滑膜組織均有明膠酶-B的高表達(dá)，認(rèn)為明膠酶-B可能是反映關(guān)節(jié)局部炎癥的標(biāo)志物，通過(guò)降解明膠及存在于軟骨中的其他膠原質(zhì)(如Ⅰ型膠原等)，參與關(guān)節(jié)軟骨破壞及RA進(jìn)展過(guò)程［7，8］。RA關(guān)節(jié)軟骨的破壞是膠原酶、基質(zhì)降解酶和明膠酶共同作用的結(jié)果［8］

佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠(AA)是一種目前公認(rèn)的研究RA經(jīng)典動(dòng)物模型。被廣泛運(yùn)用于研究RA的發(fā)病機(jī)理和新藥療效。本研究采用AA大鼠模型，觀察三痹湯對(duì)大鼠AA模型作用機(jī)制的影響。結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，模型對(duì)照組大鼠左、右后足跖腫脹度明顯增高，滑膜組織增生，呈不規(guī)則排列，大量炎細(xì)胞侵潤(rùn)，提示模型制備成功;三痹湯中、高劑量及TPT均能明顯抑制AA大鼠繼發(fā)性、自身免疫性炎癥性足腫脹，(P＜0.05)關(guān)節(jié)可見少量滑膜組織增生，排列較規(guī)則，散見炎細(xì)胞浸潤(rùn)，關(guān)節(jié)軟骨面較完整，并下調(diào)AA大鼠大鼠滑膜組織MMP-3和明膠酶-B表達(dá)水平，與TPT組比較，三痹湯高劑量組療效相當(dāng)，三痹湯中劑量組量低效遜，至于三痹湯中、高劑量是否有無(wú)明確的量效關(guān)系有待于進(jìn)一步研究。

RA屬于中醫(yī)學(xué)痹證范疇，“痹者，閉也，三氣雜至，壅閉經(jīng)絡(luò)，血?dú)獠恍校荒茈S時(shí)祛散，故久而為痹?！比詼鲎杂凇秼D人大全良方》，具有補(bǔ)氣和血、袪風(fēng)除濕、散寒止痛、益腎滋陰功效，主治由風(fēng)、寒、濕三氣雜至而成之痹癥。方中四物湯補(bǔ)血活血，四君子湯祛邪先扶正，正氣旺則邪氣不可干;獨(dú)活、秦艽、防風(fēng)驅(qū)風(fēng)濕，止痹痛;杜仲、續(xù)斷、牛膝壯筋骨，補(bǔ)肝腎;白花蛇，穿山甲、?蟲活血通絡(luò)。三痹湯諸藥合用，散藥得補(bǔ)藥以行其勢(shì)，輔正驅(qū)邪，通過(guò)抑制炎性細(xì)胞因子IL-1和TNF-a過(guò)度釋放，阻斷其誘導(dǎo)下MMP-3、明膠酶-B高水平表達(dá)，改善滑膜細(xì)胞增生引起基質(zhì)降解程度，進(jìn)而減輕或延緩關(guān)節(jié)損傷［9］，使其恢復(fù)陰陽(yáng)平衡狀態(tài)，既能顯著抑制免疫性炎癥又能“扶助正氣”，為臨床上應(yīng)用三痹湯治療RA提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。與Clio等認(rèn)為MMP-3可以作為RA患者滑膜損害的指標(biāo)并可預(yù)測(cè)疾病的預(yù)后結(jié)果一致。

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