梁穎,徐紹娜,徐放,李明珠,黃寅炎,吳勃巖
(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué),黑龍江 哈爾濱 150040)
地黃為玄參科植物地黃(Radix Rehmanniae PreParata)的新鮮或干燥塊莖。熟地黃是生地的炮制品,是中醫(yī)常用的補肝腎、益精血之品,具有補血滋陰、益精填髓的功效,是優(yōu)良的滋陰補血藥,被譽為“壯水之主,補血之君”,廣泛用于陰虛、血虛所致的各種疾病。多糖是地黃中有效成分之一,有資料表明,熟地黃多糖具有抗氧化,抗衰老[1],增強機體免疫功能等作用[2,3]。但關(guān)于熟地黃多糖在抗突變方面的文獻的報道還很少。本實驗通過三種常用的抗突變試驗,研究熟地黃多糖的抗突變作用,為其進一步研究提供依據(jù)。
1.1 實驗動物 昆明種小鼠,由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥物安全性評價中心提供。
1.2 藥品與試劑 熟地黃(購于同仁堂);熟地黃多糖(由本實驗室提取并鑒定);環(huán)磷酰胺(上海華聯(lián)制藥有限公司);秋水仙素(上海國藥集團化學(xué)試劑有限公司);5-BrdU(南京探求生物技術(shù)有限公司)。
1.3 實驗方法
1.3.1 實驗劑量 經(jīng)抑瘤試驗證明,熟地黃多糖給藥量為500mg·kg-1時為最佳劑量,效果最為顯著。以下試驗均采用此劑量。
1.3.2 小鼠骨髓嗜多染紅細胞(PCE)微核試驗 選取20~22g的昆明種小鼠30只,雌雄各半,隨機分成3組,每組10只。陰性對照組,灌胃給生理鹽水,10d。熟地多糖組,按表1的劑量灌胃給藥10d。陽性對照組,第1~8d口服生理鹽水,第9、10d腹腔注射環(huán)磷酰胺(40mg·kg-1)。第10d給環(huán)磷酰胺6h后,處死小鼠。取股骨骨髓細胞,常規(guī)制片,Giemsa染色,油鏡下觀察。每只小鼠統(tǒng)計1000個嗜多染紅細胞,并記錄出微核細胞數(shù)。采用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件進行t檢驗,計算抑制率:
抑制率=[(陽性組出現(xiàn)數(shù)-實驗組出現(xiàn)數(shù))/陽性組出現(xiàn)數(shù)]×100
1.3.3 小鼠骨髓細胞染色體畸變試驗 選取20~22g的昆明種小鼠30只,雌雄各半,分組及給藥情況同微核試驗。第10d陽性對照組注射完環(huán)磷酰胺后2h,將所有小鼠全部腹腔注射秋水仙素(4mg·kg-1),4h后處死小鼠。取小鼠股骨骨髓細胞,37℃ KCl溶液中低滲處理30min。甲醇冰醋酸固定2次,制片,Giemsa染色,油鏡下觀察。每只動物計數(shù)100個細胞分裂相,并記錄出染色體畸變的細胞數(shù),采用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件進行t檢驗,計算抑制率。
1.3.4 小鼠骨髓細胞姐妹染色單體交換試驗 選取20~22g昆明種小鼠30只,雌雄各半,分組及給藥情況同微核試驗。所有小鼠在處死前24h,分12次腹腔注射5-BrdU,1mg·g-1。處死前4h腹腔注射秋水仙素。處死后取股骨骨髓細胞,低滲處理和固定過程同染色體畸變實驗。制片后將裝片于37℃恒溫箱內(nèi)放置3d,將分化好的裝片置于30W的紫外燈下照射30min,自然晾干,Giemsa染色,油鏡下觀察。每只動物計數(shù)30個細胞分裂相,并記錄出現(xiàn)交換的染色體數(shù)。采用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件進行t檢驗分析,計算抑制率。
2.1 熟地黃多糖對環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)微核的影響
熟地黃多糖對環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)小鼠骨髓細胞PCE微核率具有抑制作用。與陽性對照組比較,差異顯著(P<0.01),抑制率為37.87%。與陰性對照組比較,差異顯著(P<0.01),有統(tǒng)計學(xué)意義,結(jié)果見表1。該實驗結(jié)果表明,熟地黃多糖對環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的小鼠微核率有顯著的抑制作用。
2.2 熟地黃多糖對環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的小鼠骨髓細胞染色體畸變的影響
熟地黃多糖組與陽性對照組比較差異顯著(P<0.01),抑制率為21.46%,與陰性對照組比較差異顯著(P<0.01),有統(tǒng)計學(xué)意義。表明熟地黃多糖對環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的染色體畸變有良好的抑制作用。結(jié)果見表2。
2.3 熟地黃多糖對環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)骨髓細胞姐妹染色單體交換率的影響
熟地黃多糖組與陽性對照組比較存在差異(P<0.05),抑制率為25.61%,與陰性對照組比較差異顯著(P<0.01),有統(tǒng)計學(xué)意義,結(jié)果見表3。表明熟地黃多糖對環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的骨髓細胞姐妹染色單體交換率有一定的抑制作用。
表1 熟地黃多糖對CP誘導(dǎo)小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核的影響(±s)
表1 熟地黃多糖對CP誘導(dǎo)小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核的影響(±s)
注:與陽性對照組比較,**P<0.01;與陰性對照組比較,##P<0.01。
組別 熟地黃多糖(mg·kg-1) CP(mg·kg-1) 動物數(shù)(只) PCE(個) 微核率(‰) 抑制率(%)陰性對照組10 1000 2.20±0.25 -陽性對照組 - 40 10 1000 63.9±5.74 -熟地黃多糖組 500 40 10 1000 39.7±6.74**##--37.87
表2 熟地黃多糖對CP誘導(dǎo)小鼠骨髓細胞染色體畸變的影響(±s)
表2 熟地黃多糖對CP誘導(dǎo)小鼠骨髓細胞染色體畸變的影響(±s)
注:與陽性對照組比較,**P<0.01;與陰性對照組比較,##P<0.01。
組別 熟地黃多糖(mg·kg-1) CP(mg·kg-1) 動物只數(shù)(只) 骨髓細胞(個) 染色體畸變率(%) 抑制率(%)陰性對照組10 100 12.00±1.92 -陽性對照組 - 40 10 100 54.33±4.32 -熟地黃多糖組 500 40 10 100 42.67±3.93**##--21.46
表3 熟地黃多糖對CP誘導(dǎo)小鼠骨髓細胞姐妹染色單體交換的影響(±s)
表3 熟地黃多糖對CP誘導(dǎo)小鼠骨髓細胞姐妹染色單體交換的影響(±s)
注:與陽性對照組比較,*P<0.05;與陰性對照組比較,##P<0.01。
組別 熟地黃多糖(mg·kg-1) CP(mg·kg-1) 動物只數(shù)(只) 細胞數(shù)(個) 姐妹染色單體交換率(%) 抑制率(%)陰性對照組10 30 3.50±1.87 -陽性對照組 - 40 10 30 10.25±1.67 -熟地黃多糖組 500 40 10 30 7.62±1.68*##--25.61
熟地黃是中醫(yī)臨床常用藥,為補陰補血佳品。在熟地黃中,多糖的含量為3.33%[4]。除多糖外,還有梓醇、苷類、5-羥甲基糠醛等成分。有資料表明,熟地黃多糖具有抗氧化、抗衰老的作用,能夠增強機體的免疫力,低分子量的地黃多糖還具有抑瘤作用[5]。
本試驗證明,熟地黃多糖對環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的微核率有良好的抑制作用,可以有效地避免微核的發(fā)生,減少染色體的損傷。同時熟地黃多糖還對環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的骨髓細胞染色體畸變率和姐妹染色單體交換率有明顯的抑制作用。因此,我們可以推測熟地黃多糖可以通過抵抗誘變劑對染色體造成的損傷,來達到對機體遺傳物質(zhì)的保護作用,避免突變的發(fā)生,最終起到抗腫瘤作用。同時也表明,熟地黃多糖對遺傳物質(zhì)無損害作用。熟地黃多糖抗突變的作用機制還有待于進一步深入研究。
[1] 陳丁丁,戴培德,張濤.地黃煎劑消退L-甲狀腺素誘發(fā)的大鼠心肌肥厚并抑制其升高的心、腦線粒體 Ca2+、Mg2+ATP酶活力[J].中藥藥理與臨床,1997,13(4):27 -29.
[2] 苗明三.懷地黃多糖對衰老模型小鼠免疫器官的影響[J].河南中醫(yī),1999,19(3):30.
[3] 苗明三,方曉艷.懷地黃多糖免疫興奮作用的實驗研究[J].中國中醫(yī)藥科技,2002,9(3):159 -160.
[4] 紀(jì)耀華,孫瑩.地黃炮制前后總多糖含量的比較[J].中醫(yī)藥信息,1999,16(4):16 -17.
[5] 魏小龍,茹祥斌.低分子量地黃多糖對P53基因表達的影響[J].中國藥理學(xué)學(xué)報,1997,18(5):471 -474.