劉志東,郭本恒,王蔭榆,李云飛,劉振民

1上海交通大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院,上海 200240;2光明乳業(yè)技術(shù)中心乳業(yè)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海 200436;3上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院,上海 200240

乳抗氧化肽的分離純化與結(jié)構(gòu)鑒定

劉志東1,2,郭本恒2＊,王蔭榆2,李云飛3,劉振民2

1上海交通大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院,上海 200240;2光明乳業(yè)技術(shù)中心乳業(yè)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海 200436;3上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院,上海 200240

本文檢測了不同分子量范圍的WPI(乳清分離蛋白)酶解物的抗氧化活性,結(jié)果表明各個組分顯示出不同的抗氧化活性,其中分子量小于 5 kDa的組分最強(qiáng)。采用凝膠過濾色譜對分子量小于 5 kDa的WPI酶解物進(jìn)行分離,抗氧化活性強(qiáng)的組分繼續(xù)采用 RP-HPLC進(jìn)行純化。通過MALD I-TOF-MS與氨基酸組成分析鑒定該活性肽為 His-Ile-Arg。

乳清分離蛋白,抗氧化肽,分離純化,氨基酸序列

隨著科學(xué)的發(fā)展,人們逐漸認(rèn)識到機(jī)體氧化產(chǎn)生的自由基與人的衰老和許多疾病有關(guān)。因此,有關(guān)機(jī)體抗氧化的研究成為現(xiàn)代生命科學(xué)研究的前沿;獲得具有較好抗氧化活性物質(zhì)的研究也成為生物學(xué),醫(yī)學(xué)和食品科學(xué)等領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一?？寡趸挠捎谄淞己玫目寡趸钚浴⒌投?、分子量低、易于在機(jī)體內(nèi)吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)等特性而成為近年來研究的熱點(diǎn)之一[1,2]。乳清是干酪生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)品。乳清蛋白主要包括α-乳白蛋白、β-乳球蛋白,血清白蛋白和免疫球蛋白等[3]。近年來,乳清蛋白作為功能性成分在食品中廣泛應(yīng)用。乳清蛋白經(jīng)蛋白酶水解后不僅能夠顯著改善其乳化性、起泡性等性能,而且降解后產(chǎn)生的生物活性肽更易于機(jī)體的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)及利用[4]。目前國內(nèi)關(guān)于乳抗氧化肽的研究較少;國外關(guān)于乳抗氧化肽的研究也比較零散,主要是所用蛋白酶具有隨意性,功能性的檢測方法單一,尤其是關(guān)于抗氧化肽的構(gòu)效關(guān)系還沒有闡明。

目前抗氧化肽分離純化的方法主要有三種:一是凝膠過濾色譜,按照活性肽的大小進(jìn)行分離,二是離子交換色譜,按照活性肽所具有的帶電基團(tuán)的性質(zhì)和數(shù)目進(jìn)行分離:三是反相高效液相色譜 (RPHPLC),按照活性肽的疏水性強(qiáng)弱進(jìn)行分離。電噴霧-四極桿-飛行時間 (ESI-quadrupole-time of flight, ESI-Q-TOF)用于測定肽鏈的氨基酸序列[5,6]。

本研究采用超濾、凝膠過濾層析和 RP-HPLC對具有較好抗氧化活性的乳肽進(jìn)行分離純化并采用電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定,為提高乳清蛋白的附加值和深入研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

WPI酶解物 (自制);Sephadex G-15(瑞典 Pharmacia公司);α-氰基-4-羥基肉桂酸、DPPH、胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶 (Sigma-Aldrich公司);三氟乙酸,乙腈 (德國Merck公司);其他試劑均為分析純。

1.2 主要儀器

超濾裝置 Vivaflow 50(5000,10000MWCO,德國Sartorius公司);紫外檢測儀 HD-3,DBS-100自動部分收集器,DHL-B電腦定時恒流泵 (上海滬西分析儀器廠);高效液相色譜儀 (LC-8A RP-HPLC,日本島津公司);Avanti冷凍離心機(jī) (美國 Beckman Kulter公司);UV-754紫外分光光度計(jì) (上海精密科學(xué)儀器有限公司);基質(zhì)輔助激光解吸附電離飛行時間質(zhì)譜 (MALD I-TOF-TOF MS,美國應(yīng)用系統(tǒng)生物公司);LABCONCO真空凍干機(jī) (美國);Hitachi 835-50氨基酸自動分析儀(日本日立公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 WPI酶解物(WPIHs)的制備[7]

1.3.2 抗氧化活性的檢測[8]

1.3.3 乳抗氧化肽的分離純化

1.3.3.1 WPI酶解物(WPIHs)的超濾分離

將乳清分離蛋白酶解物離心,取上清液經(jīng) l0 kDa超濾膜截流分離,保留濃縮液,將濾過液經(jīng) 5 kDa超濾膜截流分離,依次制備分子量為 10 kDa以上、5～10 kDa,5 kDa以下的多肽。然后將各部分溶液進(jìn)行真空冷凍干燥,分別測定各部分的抗氧化活性。

1.3.3.2 Sephade G-15凝膠過濾層析

將分子量小于 5 kDa的凍干品上 Sephadex G-15柱(1.6 cm ×100 cm),采用 20 mM醋酸-醋酸鈉緩沖液平衡并洗脫,自動分布收集器收集,在 220 nm處紫外光檢測,收集洗脫峰;合并每次收集的相同組份凍干后,檢測其抗氧化活性。

1.3.3.3 RP-HPLC純化

樣品處理方法:由于樣品凍溶的時候有少量沉淀生成,疑是緩沖液結(jié)晶。樣品溶解后經(jīng)高速離心機(jī) 12,000×g離心 15 min,再過 0.45μm濾膜過濾后,用 RP-HPLC進(jìn)行純化。

RP-HPLC的分離純化條件:半制備型柱(μBondapak C1819 mm ×300 mm),分析型柱(μBondapak C183.9 mm×300 mm);流動相:A,5%乙腈,含 0.05%三氟乙酸 (TFA);B,80%乙腈,含0.05%TFA;檢測波長 220 nm,流速:1 mL/min,進(jìn)樣量:2 mL。梯度洗脫程序?yàn)?0～5 min,100%A;5～20 min,100%A～40%B;20～30 min,40%B～ 100%B;30～40 min,100%B;40～50 min,100%B～100%A;50～55 min,100%A。

1.3.4 乳抗氧化肽的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

在體外模擬人體自然生理消化過程:在 1%(w/ v)的樣品溶液 (樣品溶于 0.1 M的 KCl-HCl緩沖液,pH 2.0)中,加入 1%(w/w)的胃蛋白酶,于 37℃下水解 2 h(模擬胃中的消化環(huán)境),在沸水浴中保持 10 min后中止反應(yīng),冷卻至室溫,并用 2 M NaOH調(diào)節(jié) pH值至 7.0。取適量水解液在12 000× g下離心 30 min,測定上清液的活性。在剩余的中性水解液中再加入 1%(w/w)的胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶(1:1),于 37℃下水解 2 h(模擬腸道中的消化環(huán)境),然后在沸水浴中保持 10 min中止反應(yīng),冷卻至室溫,再取適量水解液于 12 000×g下離心 30 min,測定上清液的活性[9]。

1.3.5 乳抗氧化肽的結(jié)構(gòu)分析

點(diǎn)樣方式:先點(diǎn) 0.5μL的樣品于MALD I不銹鋼靶板上,自然干燥后再點(diǎn)上 0.5μL,0.5 g/Lα-氰基-4-羥基肉桂酸(CCA)溶液(溶劑為 0.1%TFA+ 50%乙腈),在室溫下自然干燥。另點(diǎn) 0.5μL 0.5 g/L CCA溶液 (不點(diǎn)樣品)作為空白對照。

質(zhì)譜分析:激光源:355 nm波長的 Nd:YAG激光器,加速電壓 20 kV,質(zhì)量掃描范圍:m/z 100～800。

MS分析參數(shù):碰撞誘導(dǎo)解離 (C ID):關(guān);相對分子質(zhì)量范圍:100～3000;固定激光強(qiáng)度:6000;數(shù)字轉(zhuǎn)換器:容度 1.0 ns。

質(zhì)譜儀的分析軟件采用 4700 Explorer T M Software。

1.3.6 乳抗氧化肽的氨基酸組成分析

將樣品置于水解管中,加入 6 M的鹽酸,真空條件下 110℃下水解 24 h,冷卻后蒸干。干物質(zhì)溶于檸檬酸緩沖液,可以測定色氨酸以外的其它氨基酸含量。

2 結(jié)果

2.1 乳抗氧化肽的分離純化

2.1.1 WPI酶解物的超濾分離

本實(shí)驗(yàn)采用木瓜蛋白酶水解乳清分離蛋白,酶解時間 4 h,先將酶解液離心去除不溶性物質(zhì),然后分別用 l0 kDa和 5 kDa兩種超濾膜對酶解液進(jìn)行超濾以獲得不同分子量范圍的乳肽。

表 1 不同分子量范圍肽的抗氧化活性Table 1 Antioxidative activity of fractions from WPI hydrolysate

以DPPH自由基清除率為指標(biāo)測定了不同分子量范圍多肽的抗氧化活性,如表 1所示?？梢娙榍宓鞍酌附馕锏姆肿恿糠秶煌淇寡趸芰ο嗖钜埠艽?。乳清蛋白酶解物的抗氧化活性成分主要集中在 5 kDa以下(WPIHs-Ⅲ)。所以,在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中主要研究了(WPIHs-Ⅲ),濃縮后凍干,置于-20℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

超濾法是根據(jù)濾膜孔徑的大小實(shí)現(xiàn)對樣品按分子量大小和形狀進(jìn)行分離,常用于樣品的分級分離和濃縮。超濾法可以按膜的截留分子量(K WCO)來對物料進(jìn)行分離以達(dá)到初步分級的目的,但精度不是很高。這是因?yàn)槠浞蛛x效果受物料微粒的電荷、分子大小及形狀等方面的影響,導(dǎo)致分級純化效率較低,在使用中應(yīng)與其它技術(shù)聯(lián)合使用,以獲得更為好的分離效果。因此,本實(shí)驗(yàn)在超濾之后再用凝膠過濾色譜和 RP-HPLC進(jìn)行分離純化。

2.1.2 Sephadex G-15凝膠過濾層析

將WPI Hs-Ⅲ的組分通過 Sephadex G-15凝膠柱來進(jìn)行分離純化,洗脫液為 20 mM的醋酸-醋酸鈉緩沖液,檢測波長為 220 nm,洗脫流速為 0.5 mL/ min。由洗脫圖 1可以看到,樣品經(jīng) Sephadex G-15凝膠柱分離后得到 5個洗脫峰WPI Hs-Ⅲ-1、WPIHs-Ⅲ-2、WPI Hs-Ⅲ-3,WPIHs-Ⅲ-4和WPIHs-Ⅲ-5,分別收集這 5個洗脫峰冷凍干燥后測定其抗氧化活性。

表 2 Sephadex G-15凝膠過濾層析分離得到組分的抗氧化活性Table 2 Antioxidant activity of fractions from WPIHs-Ⅲfraction

從表 2中可以看出,這 5個洗脫峰組分的 DPPH自由基清除率分別為 29.1%、37.4%、40.6%、53.3%和 30.2%,其中第 4個洗脫峰的自由基清除能力最強(qiáng)。WPIHs-Ⅲ-1至WPIHs-Ⅲ-5均有一定的抗氧化活性,并且按照出峰次序呈遞增的趨勢, WPIHs-Ⅲ-1和WPIHs-Ⅲ-2清除率較低,小于分離前的樣品峰;WPI Hs-Ⅲ-4洗脫峰組分的抗氧化活性最高,相對于其它洗脫峰抗氧化活性較顯著。通過比較可以發(fā)現(xiàn),凝膠柱層析的分離純化效率要比超濾高的多,雖然二者同是利用分子量大小來進(jìn)行分離純化的,但由于超濾膜的孔徑存在不均一性,膜上膜下的分離比較粗糙,而柱層析系統(tǒng)的分離借助的是紫外檢測系統(tǒng),峰與峰之間的分離要精確許多。

圖 1 Sephadex G-15凝膠層析圖譜Fig.1 Sephadex G-15 chromatogram of the fraction from WPI Hs-Ⅲ

2.1.3 RP-HPLC純化

將待分離的洗脫峰 4組分經(jīng)半制備 RP-HPLC分離后得到 6個洗脫峰 (圖 2),分別收集并冷凍干燥后測定其抗氧化活性。結(jié)果如表 3所示,其中第3個洗脫峰組分的抗氧化活性最強(qiáng)。從梯度洗脫程序看,在此區(qū)域內(nèi)采用的是降低流動相極性 (即降低流動相中水的含量)的線性梯度洗脫。

表 3 半制備RP-HPLC分離得到WPI Hs-Ⅲ-4組分的抗氧化活性Table 3 Antioxidant activity of fraction from WPIHs-Ⅲ-4 by RP-HPLC

圖2 半制備型RP-HPLC圖譜Fig.2 RP-HPLC chromatogram of fraction from WPI Hs-Ⅲ-4 by RP-HPLC

圖3 分析型RP-HPLC圖譜Fig.3 RP-HPLC chromatogram of fraction from WPI Hs-Ⅲ-4-3 by RP-HPLC

收集抗氧化活性最高峰的組分,采用分析型的RP-HPLC分離純化后得到 1個組分(圖 3)。

2.2 乳抗氧化肽的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

在研究食品中的“功能性成分”時,非常有必要檢測產(chǎn)品在各種環(huán)境下的穩(wěn)定性,包括熱穩(wěn)定性、與其他組分共處時的穩(wěn)定性及貯存穩(wěn)定性等。其中,最重要的是其在人體內(nèi)自然生理消化過程的穩(wěn)定性。許多來源于食品蛋白質(zhì)的生物活性肽在體內(nèi)測試時就喪失了它們的生物活性,這有可能是它們在胃腸道的消化過程中被水解了而降低了它們的活性[5]。生物活性肽在體內(nèi)活性的穩(wěn)定性可以直接通過動物實(shí)驗(yàn)或者臨床測試來完成。但是,通過體外實(shí)驗(yàn)的方法來模擬胃腸道系統(tǒng)的消化過程比體內(nèi)實(shí)驗(yàn)更加方便。由于胃蛋白酶-胰酶復(fù)合酶水解模式最接近人體自然生理消化過程,于是本實(shí)驗(yàn)采用了此模式來檢測乳抗氧化肽在體內(nèi)消化的穩(wěn)定性。

表 4是乳抗氧化肽經(jīng)過胃蛋白酶-胰復(fù)合酶水解后的活性比較,由表中可知,乳抗氧化肽在經(jīng)過胃腸道消化后活性變化不大,尤其是胃蛋白酶水解后的乳抗氧化肽在胰復(fù)合酶作用下幾乎不會對抗氧化活性有影響;其次,胃蛋白酶可能酶解了部分抗氧化肽,從而影響了部分肽的活性,使其自由基清除率略有降低。

表 4 乳抗氧化肽WPIHs-Ⅲ-4-3經(jīng)胃腸道酶消化后的活性Table 4 Antioxidant activity ofWPIHs-Ⅲ-4-3 before and after digestion with pepsin and pancreatin

2.3 乳抗氧化肽的結(jié)構(gòu)分析

質(zhì)譜法測定肽或蛋白質(zhì)的序列是根據(jù)質(zhì)譜中的碎片離子來推導(dǎo)的,質(zhì)譜中出現(xiàn)的序列信息碎片主要是通過酰胺鍵 (肽鍵)斷裂所形成 (圖 4)。這些碎片還可以進(jìn)一步形成脫水、脫氨的離子,但 b型和y型離子出現(xiàn)這種碎片的幾率較大。根據(jù) P.Roepstorf和 J.Fohlman提出的命名系統(tǒng) (由 Bieman等修正)[10],N端碎片離子用英文字母 a,b,c等表示,C端離子用字母 x,y,z等表示 (圖 4)。其中,y型離子的一般結(jié)構(gòu)為+H2-(HNCHRCO)nOH,b型離子為 H,a型離子為 H(HNCHRCO)n-1,N=,下標(biāo)代表氨基酸殘基所處的位置。由于這幾組碎裂峰的豐度相對較高,因此,它們是確定氨基酸序列的主要依據(jù)。

圖 4 肽主鏈斷裂及其碎片命名Fig.4 Sketch map of fragment peptide back bone and the nomenclature

目的峰的質(zhì)譜鑒定結(jié)果見圖 5和 6。從圖 6可以看出,質(zhì)譜圖中大部分出現(xiàn)的是 b和 y系列碎片,這驗(yàn)證了肽鏈中酰胺鍵較容易斷裂的推斷,其中豐度較強(qiáng)的主要離子峰都可以從結(jié)構(gòu)上進(jìn)行解釋。此外,堿性氨基酸對肽鍵斷裂也有特殊的作用,它們的質(zhì)子親和能較高,具有使質(zhì)子在肽鏈或碎片上定位的傾向。如果精氨酸在肽鏈的 N端,碎裂中傾向于產(chǎn)生N端離子,精氨酸在 C端則傾向于產(chǎn)生 C端離子[11]。由于木瓜蛋白酶水解作用的專一性較強(qiáng),只斷裂賴氨酸或精氨酸羧基末端參與形成的肽鍵,精氨酸應(yīng)在肽鏈的 C末端。因此,質(zhì)譜圖中應(yīng)是 y系列的離子 (圖 5)。經(jīng)過軟件分析并標(biāo)注 (圖 6),可以看出在此區(qū)域內(nèi)顯示 H(His)、I(Ile)、R(Arg)3種氨基酸的多個相關(guān)特征離子峰,其中分別標(biāo)注為H、I和 R的 3個峰所對應(yīng)的是這 3種氨基酸的亞氨正離子的質(zhì)荷比[12]。由于 L(Leu)與 I(Ile)的相關(guān)特征離子峰是完全相同的。因此,圖 6中的離子峰是可能是 I。在得到肽段的氨基酸殘基種類的信息之后,運(yùn)用De Novo Explorer分析軟件對這幾種氨基酸排列的順序進(jìn)行分析。經(jīng)過分析,我們認(rèn)為這個肽組分的氨基酸序列為 H I(L)R。由于軟件無法區(qū)分L(Leu)與 I(Ile)。因此,必須結(jié)合氨基酸組成分析的結(jié)果進(jìn)行分析,這樣可以最后確定肽段中氨基酸的種類和數(shù)量。

2.4 乳抗氧化肽的氨基酸組成分析

乳抗氧化肽的氨基酸組成分析結(jié)果表明:該肽主要由組氨酸 (His,H),異亮氨酸 (Ile,I)和精氨酸(Arg,R)組成,相對摩爾比例為 1∶1∶1,相對分子質(zhì)量為 425.28 Da。

國際上通常要求相對分子質(zhì)量低于 1000的物質(zhì)的測定值與計(jì)算值的誤差應(yīng)在 5×10-6以內(nèi),根據(jù)這個肽段所得出的精確計(jì)算的相對分子質(zhì)量為425.28 Da,其分子離子 [M +H]+質(zhì)量則應(yīng)為425.288+1.0078=426.2958。

由于MALD I-TOF-TOF-MS的分析結(jié)果精度很高,質(zhì)荷比精度高達(dá) 0.0001。與 ESI-MS最重要的區(qū)別是由于能夠得到有特征性的二級譜圖,可以得到確定的氨基酸序列,而且方便快捷,但儀器較為昂貴。氨基酸組成分析則是對這一方法有力的佐證和必要的補(bǔ)充。綜上所述,實(shí)驗(yàn)從質(zhì)譜和氨基酸組成分析兩方面確證抗氧化肽的氨基酸序列為 H I R (His-Ile-Arg)。

3 討論

本研究采用不同的超濾膜對乳清分離蛋白的木瓜蛋白酶酶解物實(shí)行了分級,并對不同分子量大小的組分進(jìn)行了抗氧活性檢測。在各組分中,分子量小于 5 kDa的酶解物抗氧化性最強(qiáng)。目前已經(jīng)報道的各種抗氧化肽的分子量都較小,氨基酸殘基的數(shù)目一般在 20個以內(nèi)。Chen等[13]從β-伴大豆球蛋白酶解物中分離到的 6種抗氧化肽,它們是由 5-16個氨基酸殘基構(gòu)成;Se-Kwon等[14]在分步酶解阿拉斯加鰭魚皮制備抗氧化肽時,酶解到第 2步得到的抗氧化肽其分子量在 1.5～4.5 kDa的范圍;沈蓓英[15]利用酸性蛋白酶AP水解大豆分離蛋白得到了分子量約 0.7 kDa的抗氧化肽;劉大川[16]利用堿性蛋白酶 2709水解大豆分離蛋白得到了分子量在 2 kDa以下的抗氧化肽。Niranjan Rajapakse等[17]將魷魚肉酶解液根據(jù)分子量的不同分為 10 kDa以上、5～10 kDa,3～5 kDa和 3 kDa以下四個部分,它們在亞油酸體系中對 7天后亞油酸的抗氧化率分別為18.27%,23.32%,48.45%和 67.39%,這些抗氧化肽的分子量大小與本試驗(yàn)結(jié)果相近。實(shí)驗(yàn)中采用C18柱,進(jìn)行線性梯度洗脫,成功的將凝膠過濾層析后的組分進(jìn)行了分離,獲得了相對較純的抗氧化肽。

蛋白質(zhì)和多肽氨基酸序列測定的傳統(tǒng)方法是以DNA順序分析和 Edman降解為基礎(chǔ)的測序方法,即N端測序法。DNA順序測定解決不了翻譯后加工所導(dǎo)致的氨基酸殘基的修飾的問題,N端測序法的缺點(diǎn)是不能測定 N端修飾的蛋白質(zhì)或多肽[18]。除非經(jīng)過脫修飾反應(yīng),使 N端的氨基酸釋放出來。而且對于小的肽段,Edman降解法常常不能測定全序列,可能是由于小肽在支持劑上不能牢固地吸附的原因。近年來,生物質(zhì)譜的發(fā)展,尤其是納升電噴四極桿-飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜 (Nano-ESI-Q-TOF electrspectrometry ionization-quadrupole-time of flight)的出現(xiàn)為蛋白質(zhì)及多肽的測序開辟了一個新天地,成為鑒定微量蛋白質(zhì)及蛋白質(zhì)翻譯后修飾的有力工具[19-23]。電噴霧質(zhì)譜是根據(jù)肽段經(jīng)惰性氣體碰撞而誘導(dǎo)裂解產(chǎn)生的一系列有規(guī)律的碎片離子之間的質(zhì)量差來推斷氨基酸序列。納升電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜就是在四極桿-飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜 (Q-TOF)上配備一個納升噴霧源,該方法使蛋白質(zhì)及多肽的測序不再受翻譯后修飾及純度的限制,與常用的三、四級電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜或離子阱電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜比較,四級桿-飛行時間電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜 (Q-TOF-ESI-MS/MS)具有更高的分辨率、靈敏度和質(zhì)量準(zhǔn)確度,更適合蛋白質(zhì)及多肽測序,測定結(jié)果準(zhǔn)確可靠。本研究采用納升電噴霧-四極桿-飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)對乳清分離蛋白酶解物中分離獲得的肽段的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了鑒定。

4 結(jié)論

4.1 采用超濾膜對乳清分離蛋白酶解物進(jìn)行超濾處理,分子量在 5 kDa以下的乳清分離蛋白酶解物對DPPH自由基率的清除率最高。

4.2 采用 Sephadex G-15凝膠過濾層析法對低分子量酶解物進(jìn)行了分離,20 mM的醋酸-醋酸鈉緩沖液進(jìn)行洗脫,收集DPPH自由基清除能力最強(qiáng)的洗脫峰。樣品凍干后,采用 RP-HPLC繼續(xù)純化,得到抗氧化活性最強(qiáng)的洗脫峰。MALD I-TOF-TOF-MS及氨基酸組成結(jié)果分析表明抗氧化活性強(qiáng)的組分中的肽為 His-Ile-Arg。

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Isolation and Identification of Antioxidative Peptide Derived from M ilk Protein

L IU Zhi-dong1,2,GUO Ben-heng2＊,WANG Yin-yu2,L I Yun-fei3,L IU Zhen-min2

1School of Life Sciences and B iotechnology,Shanghai Jiaotong University,Shanghai 200240,China;2State Key Laboratory of Dairy B iotechnology,Technical Center,B right Dairy Co.L td,Shanghai 200436,China;3School of Agriculture and B iology,Shanghai Jiaotong University,Shanghai 200240,China

The evaluation of antioxidative activity ofWPI(whey protein isolates)hydrolysates showed that the fraction with molecularweight below 5 kDa possessed the highest antioxidative activity.The most active fraction was obtained by gel filtration chromatography,and further separated by RP-HPLC.The purified peptide was determined to be His-Ile-Arg byMALD I-TOF-MS and amino acid analysis.

WPI;antioxidative peptide;isolation and purification;sequence of peptide

TS252.7

A

1001-6880(2010)05-0740-07

2009-10-26 接受日期:2010-02-04

“十一五”國家科技支撐計(jì)劃(2006BAD04A14, 2006BAD04A06);“863”國家計(jì)劃項(xiàng)目(2007AA10Z353)

＊通訊作者 Tel:86-532-88963253;E-mail:zdliu1976@163.com