張林田，陳小雪，魏建華，張冬輝，陳建偉

（汕頭出入境檢驗檢疫局，廣東汕頭515041）

反相高效液相色譜法檢測食品添加劑乳鐵蛋白

張林田，陳小雪，魏建華，張冬輝，陳建偉

（汕頭出入境檢驗檢疫局，廣東汕頭515041）

建立反相高效液相色譜法檢測食品添加劑乳鐵蛋白的方法。樣品采用氯化鈉溶液（0.5 mol/L）溶解，過濾后供液相色譜儀測定。采用CAPCELL SG300 C18色譜柱分離，氯化鈉溶液（0.5 mol/L）、乙腈及三氟乙酸為流動相，梯度洗脫，二極管陣列檢測器280nm檢測，保留時間及特征光譜圖定性，外標(biāo)法峰面積定量測定。標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍10.0mg/L～100 mg/L，相關(guān)系數(shù)均在0.999以上，定量檢測低限5 mg/kg。

高效液相色譜；添加劑；乳鐵蛋白

Abstract：A determination of food additive lactoferrin by reverse phase high-performance liquid chromatography is described.The lactoferrin is extracted from the samples with the sodium chloride solution of 0.5 mol/L,filtered,and analyzed at 280 nm by high-performance liquid chromatography with DAD.The chromatographic separation is carried out on CAPCELL SG300 C18column with ramp mobile phase using the sodium chloride solution of 0.5 mol/L,acetonitrile and trifluoroacetic acid.The qualitation of lactoferrin depends on the RT and characteristic UV spectra;quantified by external standard calibration curves.The calibration curve is linear in the 10.0 mg/L-100 mg/L range with correlation coefficients≥0.999.The limit of detection and quantification is 5 mg/kg.The analytical method is simple,fast and precise with a good sensitivity,an excellent reproducibility.

Key words:HPLC;additive;lactoferrin

乳鐵蛋白是淺紅色，干燥、均勻的粉末，無味，是一種鐵結(jié)合性糖蛋白，屬于轉(zhuǎn)鐵蛋白家族。分子的主體由氨基酸殘基構(gòu)成的、相對分子質(zhì)量80 ku，它被認(rèn)為是安全的食品添加劑，日本、美國等許多國家批準(zhǔn)其應(yīng)用于食品行業(yè)已有幾十年[1]，我國GB 2760-2007《食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》中允許乳鐵蛋白添加于嬰幼兒配方食品、較大嬰兒和幼兒配方食品中，最大允許使用量為1.0 g/kg。

商業(yè)所用乳鐵蛋白主要來源于牛乳，目前國外主要采用離子交換色譜和超濾等方法從廢棄乳清或脫脂奶粉中提取，生產(chǎn)成本較高[1]，每公斤乳鐵蛋白售價約1800元，是普通蛋白粉的6倍。而國內(nèi)乳鐵蛋白由于生產(chǎn)工藝技術(shù)尚未成熟，純度低、價格高，還未能工業(yè)化生產(chǎn)。市場上常見的乳鐵蛋白添加劑大體都是采用純度大于90%的進口產(chǎn)品。由于乳鐵蛋白（LF）價格昂貴，許多不法分子以次充好，以低純度LF冒充優(yōu)質(zhì)乳鐵蛋白添加劑以獲取暴利，坑害消費者的權(quán)益。我國對食品添加劑乳鐵蛋白的需求越來越多，但目前尚無國家標(biāo)準(zhǔn)。為了規(guī)范市場，保障人民身體健康，建立乳鐵蛋白的檢測方法是迫在眉捷。參考國內(nèi)外文獻，經(jīng)試驗驗證，建立了高效液相色譜法檢測乳鐵蛋白含量，該方法采用氯化鈉溶液溶解樣品，過濾后供液相色譜儀測定，采用CAPCELL SG300 C18色譜柱分離，氯化鈉溶液、乙腈及三氟乙酸為流動相，梯度洗脫，二極管陣列檢測器280 nm檢測，保留時間及特征光譜圖定性，外標(biāo)法峰面積定量測定。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑

HP1100高效液相色譜儀，配置二極管陣列檢測器，美國惠普公司生產(chǎn)。

乙腈、三氟乙酸、0.5 mol/L氯化鈉溶液。

標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取50.0 mg乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)品于燒杯中，用少量氯化鈉溶液溶解后轉(zhuǎn)移到50 mL容量瓶中并定容，配制成濃度為1000 mg/L標(biāo)準(zhǔn)儲備液。

1.2 液相色譜分離條件

色譜柱：CAPCELL SG300 C18柱，4.6 mm×150 mm，粒度5μm（或相當(dāng)色譜柱）。流速：1mL/min。柱溫：30℃。檢測波長：280 nm。進樣量：25 μL。流動相 A：乙腈-氯化鈉溶液-三氟乙酸=45＋450＋0.15，B:乙腈-氯化鈉溶液-三氟乙酸=500＋500＋0.30。梯度洗脫見表1。

表1 梯度洗脫Table 1 The composition and ramp mobile phase

1.3 樣品前處理

稱取100 mg試樣（精確至0.1 mg）用氯化鈉溶液溶解，轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中并定容。再依據(jù)實際需要稀釋適當(dāng)倍數(shù)。

2 結(jié)果和討論

2.1 液相色譜柱的選擇

在本試驗中，比較了 Vydac C18、MERCK C18、Agilent C18、CAPCELL SG300 C18等各種類型的色譜柱，只有CAPCELL SG300 C18柱能使乳鐵蛋白得到良好分離，同時保留時間也合適。這可能是由于蛋白體積大，易與硅膠金屬發(fā)生親合作用形成鹽，產(chǎn)生了較多的死吸附，峰形變得較差，峰拖尾、分配性差。CAPCELL SG300色譜柱采用包膜之后硅羥基的殘留量接近0，使得蛋白里的氨基酸尾部沒有機會與硅羥基咬合，因此不會在分離過程中產(chǎn)生死吸附。

2.2 流動相的選擇

本試驗在進行流動相的選擇時，比較了0.1%TFA水溶液與甲醇-水-0.1%TFA（95∶5∶0.1）、異丙醇-水-0.1%TFA（95∶5∶0.1）、10 mmol/L 磷酸、乙腈-氯化鈉溶液-三氟乙酸（45＋450＋0.15）[2]作為流動相對乳鐵蛋白的分離效果，結(jié)果表明，選用乙腈-氯化鈉溶液-三氟乙酸（45＋450＋0.15）及乙腈-氯化鈉溶液-三氟乙酸（500＋500＋0.30）作為流動相并梯度洗脫，能使主成分與相鄰雜蛋白峰基線分離，同時保留時間也較為合適。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)色譜圖、標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)及檢測低限

將乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)儲備液用氯化鈉溶液配成10、20、40、60、80、100 mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)系列，進高效液相色譜儀測定，以濃度對應(yīng)峰面積建立校準(zhǔn)曲線，校準(zhǔn)方程為Y=1.36503X-4.50996，相關(guān)系數(shù)為0.9987。根據(jù)6×SD/b（SD為6次空白的標(biāo)準(zhǔn)偏差；b為標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率）結(jié)合具體情況，確定最低出限為5 mg/L。圖1為50 mg/L乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液液相色譜圖，乳鐵蛋白保留時間為9.6 min。圖2為對應(yīng)的二極管陣列光譜圖。樣品以保留時間結(jié)合光譜圖輔助定性。

2.4 特異性試驗

乳鐵蛋白通常采用pH調(diào)節(jié)、鹽析、酸沉降、陽離子交換層析分離純化技術(shù)，但殘存的雜蛋白，如血清白蛋白（牛）、β-乳球蛋白等有可能對測定存干擾。驗證血清白蛋白（牛）、β-乳球蛋白與乳鐵蛋白在同樣液相條件下的分離效果，試驗結(jié)果表明，血清白蛋白（牛）、β-乳球蛋白保留時間分別為8.36min和8.25min，而乳鐵蛋白的保留時間則為9.64 min。圖3為3種蛋白等濃度混合溶液的液相色譜圖。

2.5 精密度試驗驗證

按上述10份乳鐵蛋白樣品，按本檢測方法取進行測定，結(jié)果如表2。

從試驗結(jié)果可知，10次測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.7%。另請5家單位對我們所提供的3份樣品按本法進行乳鐵蛋白含量測定。試驗數(shù)據(jù)見表3，由試驗數(shù)據(jù)可知，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于2%。說明該方法室間定內(nèi)的重現(xiàn)性均能滿足要求。

表2 乳鐵蛋白精密度試驗驗證結(jié)果Table 2 Results of inner-lab reproducibility（n=10）

表3 乳鐵蛋白室間驗證數(shù)據(jù)Table 3 Results of inter-lab reproducibility（n=12）

3 結(jié)論

本研究用氯化鈉溶液溶解樣品后直接采用高效液相色譜測定，以保留時間及特征光譜圖定性，外標(biāo)法峰面積定量測定添加劑中乳鐵蛋白含量，具有簡便、快速、準(zhǔn)確、高效的優(yōu)點。

[1]龔廣予,巫慶華,吳正鈞.乳鐵蛋白的生理功能[J].中國乳品工業(yè),2001,29(1):21

[2]許寧,李士敏.牛乳鐵蛋白的反相高效液相色譜法含量測定[J].藥物分析雜志 ，2004，24(1)：49-51

Study of Determination of Food Additive Lactoferrin by High Performance Liquid Chromatography

ZHANG Lin-tian，CHEN Xiao-xue，WEI Jian-hua，ZHANG Dong-hui，CHEN Jian-wei
（Shantou Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Shantou 515041,Guangdong,China）

2010-04-13

國家質(zhì)檢總局項目（20071903-T-424）

張林田（1971—），男（漢），高級工程師，大學(xué)，從事食品衛(wèi)生檢測。