張蓮姬

（延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林龍井133400）

泥鰍魚黑色素抗氧化作用

張蓮姬

（延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林龍井133400）

采用熒光光度法和分光光度法研究泥鰍魚黑色素清除羥基自由基、有機(jī)自由基DPPH以及抑制蛋黃的脂質(zhì)過(guò)氧化作用。試驗(yàn)結(jié)果表明：在一定濃度范圍內(nèi)隨著泥鰍魚黑色素濃度的增加，黑色素的抗氧化作用逐漸增強(qiáng)，但濃度增加到一定程度其抗氧化作用的增強(qiáng)不再明顯。清除50%的羥基自由基和有機(jī)自由基DPPH所需要的泥鰍魚皮黑色素的濃度分別為0.38 mg/mL和0.1 mg/mL，抑制蛋黃的脂質(zhì)過(guò)氧化試驗(yàn)中抑制率達(dá)到50%時(shí)泥鰍魚皮黑色素濃度為0.22 mg/mL。

泥鰍魚；黑色素；清除；抗氧化性

Abstract:Based on the fluorophotometry and spectrophotoemtry,this paper mainly studies that the loach melanin eliminates the hydroxyl radical,organic radical DPPH and inhibits the lipid peroxidation of the yolk.Experimental results show that with the loach melanin concentration's increase in a certain range,the antioxidant of the melanin is getting bigger and bigger.However,when the concentration increases to a certain level,the strength of the antioxidant is not so obvious any more.The concentration that needs to eliminate 50%of the hydroxyl radical and organic radical DPPH are 0.38 mg/mL and 0.1 mg/mL respectively.The concentration of the loach melanin is 0.22 mg/mL,when the rate of inhibition achieves 50%in the experiment of lipid peroxidation of the yolk.

Key words:loach;melanin;eliminating;antioxidant

黑色素（Melanin）是一類復(fù)雜的含氮高聚物，它是廣泛存在于植物、動(dòng)物和微生物中的重要色素，是酪氨酸及其相關(guān)化合物代謝的最終產(chǎn)物[1]，具有與眾不同的物理化學(xué)特性和重要的生理特征。動(dòng)物源黑色素大致可分為兩大類[2]：真黑色素（EumcLanin），它是黑色或棕色的含氮大分子；淺黑色素（Pheomclanin），它是紅色、黃色或棕色的色素。

天然黑色素雖然對(duì)于生物的生長(zhǎng)、發(fā)育不是必不可少的，但卻能提高生物生存、競(jìng)爭(zhēng)的能力[3]。不同來(lái)源的黑色素都有一定的特異性，具有很大應(yīng)用潛力，所以天然黑色素資源開發(fā)是當(dāng)前研究的一大熱點(diǎn)。

進(jìn)入21世紀(jì)一些天然黑色素逐漸應(yīng)用在各個(gè)領(lǐng)域中。如在食品工業(yè)中黑芝麻、黑米、黑豆中的黑色素應(yīng)用在飲料、糖果、糕點(diǎn)、巧克力、果醬等[4]。研究還表明，黑色素具有抗氧化和防止衰老等功能[5]，這將大大促進(jìn)天然黑色素在保健食品中的應(yīng)用。天然黑色素在化學(xué)工業(yè)上也日益受到歡迎，可在黑發(fā)劑、防曬霜等產(chǎn)品中應(yīng)用。黑色素除具有上述作用外，還具有以下幾個(gè)方面藥理作用[6]：具有延長(zhǎng)腎上腺素活性作用，從而維持血管產(chǎn)生滲透壓，降低血管脆性，縮短流血時(shí)間；抗菌作用，其作用受其濃度影響，低濃度能抑制細(xì)菌，高濃度能殺菌；抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)或抗癌作用；解痙攣?zhàn)饔?；用以治療某些與黑色素缺乏有關(guān)神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如著色性干皮病、帕金森氏癥、老年性癡呆癥、亨廷氏舞蹈病等[7-8]。

近年來(lái)發(fā)現(xiàn)一些可溶性黑色素在體外對(duì)艾滋病病毒有顯著的抑制作用，使天然黑色素將來(lái)有可能成為一種新的艾滋病藥物[9]。所以天然黑色素替代合成黑色素，有著十分廣闊的應(yīng)用前景，越來(lái)越受到人們的青睞，許多科研工作者已經(jīng)對(duì)其進(jìn)行研究開發(fā)[10-16]。

泥鰍生活于湖塘、溝渠、水田等地方，除西部高原外，全國(guó)南北各地均有分布，是常見的淡水小型食用魚類，其肉質(zhì)細(xì)嫩，是一種營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高的黑色食品。而且泥鰍魚原料易得，從其中提取黑色素的工藝很簡(jiǎn)單，這些特點(diǎn)都證明泥鰍魚具有較高的研究?jī)r(jià)值和開發(fā)潛力，但目前為止鮮見有關(guān)泥鰍魚皮黑色素抗氧化作用報(bào)道。為了有效地開發(fā)、研究和利用這一天然資源，本文研究了泥鰍魚皮黑色素清除羥基自由基、有機(jī)自由基DPPH以及抑制蛋黃的脂質(zhì)過(guò)氧化作用，提出了有意義的參考數(shù)據(jù)。

1 材料、試劑與儀器

1.1 材料

泥鰍魚購(gòu)買于吉林省龍井市市場(chǎng)。

1.2 試劑

試劑：NaOH溶液、CuSO4溶液、苯甲酸溶液、抗壞血酸溶液、pH=7.4磷酸緩沖溶液、DPPH溶液、95%乙醇、硫代巴比妥酸、蛋黃懸液、正丁醇、醋酸。

1.3 儀器

HH-S恒溫水浴鍋：金壇市恒豐儀器廠；TDL-5000B型低速冷凍多管離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；FA/JA型電子天平、PHS-3C型精密pH計(jì)、756MC紫外可見分光光度計(jì)、960MC熒光分光光度計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；振蕩器；電熱鼓風(fēng)干燥箱：天津?qū)嶒?yàn)儀器廠。

2 方法

2.1 泥鰍魚皮黑色素提取分離工藝流程

干泥鰍→粉碎→酸水解→離心→過(guò)濾→堿溶→靜置12 h→離心→過(guò)濾→酸沉→靜置12 h→離心→乙醇洗滌→干燥→粗黑色素

2.2 泥鰍魚皮黑色素的提取及純化

黑色素在體內(nèi)與蛋白質(zhì)、多糖結(jié)合緊密，不易分離。本試驗(yàn)首先采用鹽酸來(lái)水解去除與黑色素結(jié)合的蛋白質(zhì)、碳水化合物和脂類物質(zhì)，然后利用黑色素易溶于堿的性質(zhì)提取黑色素，最后加酸使黑色素重新沉淀出來(lái)。

2.2.1 泥鰍魚黑色素的酸水解

將粉碎的干燥泥鰍20.00 g，放入500 mL錐形瓶中，加入 200 mL、5 mol/L HCl，在 60℃條件下水解 3 h，時(shí)而攪拌，適當(dāng)蓋上蓋子。離心去除濾液后得到含黑色素的沉淀物。

2.2.2 泥鰍魚黑色素的堿溶

離心所得到的沉淀物用蒸餾水洗至中性后加入200 mL、5 mol/L NaOH，室溫靜置 12 h，離心即得到含有黑色素的濾液。

2.2.3 泥鰍魚黑色素的酸沉

將離心所得到的含有黑色素的濾液用5 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH值至1，使黑色素沉出，室溫靜置12 h，離心分離，其沉淀即為泥鰍黑色素粗提取物。

2.2.4 泥鰍魚黑色素的純化

將泥鰍黑色素粗提取物，用鹽酸和氫氧化鈉進(jìn)行重結(jié)晶后，用蒸餾水反復(fù)洗滌（至少5次）至濾液不含氯離子為止（用0.1 mol/L的硝酸銀溶液檢查），最后用乙醇洗滌，60℃烘干干燥得成品。

2.3 泥鰍魚黑色素清除羥自由基的測(cè)定

用熒光分光光度法測(cè)定[17]，其原理為通過(guò)硫酸銅和抗壞血酸反應(yīng)體系產(chǎn)生羥自由基，羥自由基可氧化苯甲酸且其產(chǎn)物在一定的激發(fā)波長(zhǎng)下具有較強(qiáng)的熒光，黑色素能有效地清除活性氧自由基，導(dǎo)致反應(yīng)體系熒光強(qiáng)度減弱。

在10 mL具塞比色管中加入5.0 mLpH＝7.4的磷酸鹽緩沖溶液、0.3 mL 1.14 mmol/L的硫酸銅溶液、1.2 mL0.925mmol/L的苯甲酸溶液和1.0mL0.97mmol/L的抗壞血酸溶液，之后定容至10 mL搖勻，在室溫下放置30 min，在激發(fā)波長(zhǎng)為294 nm條件下測(cè)定411 nm處的熒光強(qiáng)度（I）。同時(shí)作空白試驗(yàn)在相同條件下不加硫酸銅溶液和抗壞血酸溶液，測(cè)其熒光強(qiáng)度為I0（空白值），則實(shí)際由羥自由基與苯甲酸反應(yīng)產(chǎn)生的體系的熒光強(qiáng)度為（I-I0）（羥基自由基的產(chǎn)生階段）。在若干個(gè)上述反應(yīng)體系中分別加入不同濃度的黑色素溶液（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg/L），在相同的激發(fā)波長(zhǎng)下測(cè)得其熒光強(qiáng)度Im，羥自由基清除率與黑色素加入量正相關(guān)[17]，羥自由基清除率的計(jì)算公式如式（1）：

2.4 泥鰍黑色素清除有機(jī)自由基DPPH的測(cè)定

測(cè)定原理：DPPH（1,1-二苯基苦基苯肼）在517 nm處有一較強(qiáng)吸收峰，其乙醇溶液呈深紫色。當(dāng)有自由基清除劑存在時(shí)，由于與其單電子配對(duì)而使其吸收逐漸消失，其褪色程度與其接受的電子數(shù)成定量關(guān)系，因而可用分光廣度法進(jìn)行定量分析。

向2 mL DPPH溶液中加入2 mL不同濃度的黑色素溶液，總體積為4 mL，搖勻，于25℃水浴中放置30 min后倒入光徑為1 cm的比色皿中，用紫外可見分光光度計(jì)在517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定上清液的吸光度A樣品（用2 mL 95%乙醇和其對(duì)應(yīng)濃度的黑色素溶液來(lái)調(diào)零點(diǎn)，以扣除試劑本身的顏色影響），向2 mL DPPH溶液中加入2 mL相應(yīng)黑色素溶液的溶劑（0.1 mol/L NaOH溶液，用2 mL 95%乙醇和其黑色素溶液的溶劑來(lái)調(diào)零點(diǎn)），記錄吸光度值為A空白，即空白對(duì)照,DPPH的清除率的計(jì)算公式如式（2）[18]：

2.5 泥鰍魚黑色素抑制蛋黃的脂質(zhì)過(guò)氧化作用

參考硫代巴比妥酸反應(yīng)物質(zhì)法（TBARS法），TBARS方法是通過(guò)硫代巴比妥酸與丙二酚及其他脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物的顯色（淡紅色）反應(yīng)來(lái)進(jìn)行檢測(cè)的一種方法。反應(yīng)產(chǎn)物在532 nm波長(zhǎng)處的吸光度值可以表征脂質(zhì)過(guò)氧化的程度。取3支10 mL試管，分別在其中加入2 mL 10%的蛋黃懸液，1 mL不同濃度的黑色素水溶液，然后加入10%的三氯乙酸2 mL，0.8%的硫代巴比妥酸（含1.1%SDS十二烷基硫酸鈉）2 mL。將幾支試管渦流振蕩混合均勻，在95℃下加熱60 min。冷卻至室溫后，振蕩均勻，以3000 r/min離心10 min。然后用紫外可見分光光度計(jì)在532 nm波長(zhǎng)處測(cè)定上清液的吸光度，同時(shí)按上述方法測(cè)不加黑色素的吸光度。黑色素的最終濃度為 0.05、0.10、0.20、0.25、0.30 mg/mL。按式（3）計(jì)算黑色素的抗氧化指數(shù)AI%[19]：

式中：AC為不含黑色素體系的吸光度；AT為含黑色素體系的吸光度。

3 結(jié)果與分析

3.1 熒光光度法測(cè)定泥鰍魚黑色素

圖1為熒光分光光度法測(cè)定的不同濃度的泥鰍魚黑色素對(duì)羥自由基的清除率的影響。

圖1表明隨著泥鰍魚黑色素加入量的增加，羥自由基的清除率也逐漸增加。但是當(dāng)其濃度增加到一定程度（0.6 mg/L）以后，清除率的增加已不明顯。當(dāng)泥鰍魚黑色素濃度達(dá)到1.2 mg/mL時(shí)，其抑制率達(dá)到70%，對(duì)清除羥自由基的效果最好。IC50（抑制率達(dá)到50%時(shí)黑色素濃度）為0.38 mg/L。

3.2 黑色素清除有機(jī)自由基DPPH的能力分析

圖2為分光光度法測(cè)定的不同濃度的泥鰍魚黑色素對(duì)DPPH自由基清除率的影響。

圖2表明泥鰍魚黑色素濃度在0.025 mg/mL~0.2 mg/mL范圍內(nèi)抑制率逐漸上升，但當(dāng)黑色素濃度高于0.2 mg/mL以后其抑制率增加基本趨于平穩(wěn)。當(dāng)泥鰍魚黑色素濃度達(dá)到0.2 mg/mL時(shí)，其抑制率達(dá)到59%，對(duì)清除DPPH自由基的效果最好。IC50（抑制率達(dá)到50%時(shí)黑色素濃度）為0.1 mg/mL。

3.3 黑色素抑制蛋黃的脂質(zhì)過(guò)氧化作用分析

圖3為按照TBARS方法測(cè)定的不同濃度的泥鰍魚黑色素對(duì)蛋黃脂質(zhì)過(guò)氧化抑制率的影響。

圖3結(jié)果表明泥鰍魚黑色素在0.05 mg/mL~0.25 mg/mL濃度范圍內(nèi)抑制率為逐漸上升的趨勢(shì)，但當(dāng)黑色素濃度繼續(xù)增大0.25 mg/mL時(shí)，清除率趨于平緩。黑色素濃度在0.25 mg/mL時(shí)其對(duì)蛋黃脂質(zhì)過(guò)氧化的抑制率效果最好，抑制率為52%。IC50（抑制率達(dá)到50%時(shí)黑色素濃度）為0.22 mg/mL。

3.4 泥鰍魚黑色素與其他抗氧化劑的比較

為了進(jìn)一步證明，泥鰍魚黑色素較強(qiáng)的抗氧化作用，與另外兩種典型抗氧化劑硫脲和尿素比較了清除羥自由基的能力，結(jié)果如表1。

表1 泥鰍魚黑色素與其他抗氧化劑清除50%羥自由基能力的比較Table 1 Comparison of loach melanin and other antioxidants on the ability of eliminating 50%hydroxyl radicals

從表1中可以看出，泥鰍魚黑色素對(duì)羥自由基的清除率高于硫脲和尿酸，特別是在一定濃度范圍內(nèi)這種優(yōu)勢(shì)更明顯。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)首先利用天然黑色素溶于堿，酸沉的性質(zhì)，從干泥鰍魚中提取黑色素，并且對(duì)它進(jìn)行提純。所得到的干燥的泥鰍魚黑色素配成不同的濃度，然后采用熒光光度法和分光光度法研究泥鰍魚皮黑色素的抗氧化作用。得到的結(jié)果為：清除50%的羥自由基、有機(jī)自由基DPPH，抑制50%的蛋黃脂質(zhì)過(guò)氧化所需泥鰍魚黑色素濃度分別為0.38、0.1、0.22 mg/mL，清除有機(jī)自由基DPPH的效果優(yōu)于其余兩者。泥鰍魚黑色素跟其他典型抗氧化劑硫脲和尿素相比也表現(xiàn)出更好的清除羥基自由基的能力。以上結(jié)果說(shuō)明泥鰍魚黑色素具有明顯的抗氧化活性，可以有效的防止羥自由基、有機(jī)自由基DPPH等對(duì)人體造成傷害，從而提高免疫力，也提示泥鰍魚黑色素潛在的應(yīng)用價(jià)值，或許將來(lái)能成為抗衰老保健食品輔料或功能因子。但本研究所得到的泥鰍魚黑色素進(jìn)一步的分離純化和構(gòu)效關(guān)系尚待深入研究。

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Study on the Antioxidant of the Loach Melanin

ZHANG Lian-ji
（Agricultural College，Yanbian University，Longjing 133400，Jilin,China）

2010-03-18

張蓮姬（1970—），女（朝鮮），副教授，研究方向：天然色素的提取及性質(zhì)研究。