蔣潔，陳填烽，楊芳，鄭文杰

（暨南大學(xué)化學(xué)系,廣東廣州510632）

分次加碲法培養(yǎng)高富碲量小球藻及其對(duì)藻體抗氧化酶系統(tǒng)的影響

蔣潔，陳填烽，楊芳，鄭文杰*

（暨南大學(xué)化學(xué)系,廣東廣州510632）

在小球藻（Chlorella vulgaris，C.vulgaris)生長(zhǎng)周期的第 7、8、93 天分次添加無(wú)機(jī)碲（Na2TeO3），維持碲劑量（χTe：以單位生物量C.vulgaris的加碲量為碲劑量)為0.25~1.00，進(jìn)行富碲培養(yǎng)。觀察不同劑量處理組中小球藻對(duì)無(wú)機(jī)碲的富集轉(zhuǎn)化及最終生物量、水溶性蛋白含量、抗氧化酶活性的變化情況。結(jié)果表明，χTe為1.00時(shí)碲產(chǎn)量高達(dá)67.79mg/g，其中有機(jī)碲產(chǎn)量為18.62 mg/g；富碲C.vulgaris的生物量和水溶性蛋白都有明顯增加，即控制劑量在1.00以?xún)?nèi)可維持甚至促進(jìn)C.vulgaris的生長(zhǎng)。分次加碲法是小球藻高值化處理的有效途徑。

小球藻；碲；分次添加；吸收代謝

Abstract：The cultivation of high tellurium （Te）-enriched Chlorella vulgaris（C.vulgaris）was achieved by using a stepwise Te addition method,in which Te was added in the 7th,8thand 9thdays of the cell growth cycle,and Te doses（χTe）were kept constant at 0.25-1.00.The changes in biomass,water-soluble protein,antioxidant enzymes,Te accumulation and transformation in C.vulgaris were also investigated.The results indicate that the high Te-enriched C.vulgaris with a total Se content of 67.79 mg/g and organic Te content of 18.62 mg/g could be obtained with the χTeat 1.00.Moreover,stimulative effects in biomass and water-soluble protein were observed in all treatment groups by comparing with the control groups.In conclusion,the stepwise Te addition method was an effective means to achieve high value application of C.vulgaris.

Key words:Chlorella vulgaris；tellurium；stepwise addition；absord and metabolism

硒(Se)是惟一受基因調(diào)控的人體必需微量元素，具有多種生物學(xué)功能和藥理作用，如抗氧化、消炎、抗高血壓、抗腫瘤、降血糖等活性。硒代半胱氨酸已被確認(rèn)為人體的第21種必需氨基酸。大量流行病學(xué)調(diào)查研究的結(jié)果表明，缺硒將導(dǎo)致多種疾病，如克山病、心腦血管病、糖尿病、肝病、癌癥等[1]，因此，目前已經(jīng)有多種富硒、補(bǔ)硒產(chǎn)品商業(yè)化生產(chǎn)。一般認(rèn)為植物來(lái)源的含硒物質(zhì)其生物活性和生物利用度更高，是安全高效的補(bǔ)硒制劑。碲（Te）和硒是同族元素，具有相似的化學(xué)性質(zhì)和生物功能。近年來(lái)已經(jīng)有不少研究表明，有機(jī)碲化合物具有抗腫瘤和抗脂質(zhì)過(guò)氧化等多種生物功能[2-6]。

目前關(guān)于硒和碲對(duì)螺旋藻生長(zhǎng)影響及在藻體中吸收代謝的報(bào)道較多[7-10]，如陳填烽等通過(guò)分次加硒法獲得了富硒量高達(dá)1301.17 μg/g的高值化螺旋藻[8]。小球藻（C.vulgaris）含有豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸、亞麻酸、亞油酸、胡蘿卜素以及抗氧化酶，也是一種營(yíng)養(yǎng)豐富的保健品，在食品和醫(yī)藥領(lǐng)域具有較高的開(kāi)發(fā)價(jià)值。我們前期的結(jié)果也證實(shí)小球藻對(duì)硒具有一定的耐受性[11]。本文嘗試用分次加碲法培養(yǎng)高富碲小球藻，觀察不同碲劑量（χTe）處理組中小球藻對(duì)無(wú)機(jī)碲的富集轉(zhuǎn)化及最終生物量、水溶性蛋白含量、抗氧化酶活性的變化情況。結(jié)果表明，χTe為1.00時(shí)，碲產(chǎn)量高達(dá)67.79 mg/g，其中有機(jī)碲產(chǎn)量為18.62 mg/g，且藻體生物量和水溶性蛋白都有明顯增加。本試驗(yàn)所獲得的結(jié)果顯示，分次加碲法是小球藻高值化處理的有效途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

小球藻（C.vulgaris）由暨南大學(xué)水生研究所提供，暨南大學(xué)化學(xué)系生物無(wú)機(jī)研究室（1）保種。PYX-800G-A型光照培養(yǎng)箱：寧波萊?？萍加邢薰?；JY92-II型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)：寧波新芝生物科技股份有限公司；TU-1901型雙光束紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海棱光技術(shù)有限公司；智能消化儀：上海纖檢儀器有限公司；5804R高速離心機(jī)：Eppendorf公司；Perkin-Elmer電感耦合等離子體發(fā)射光譜ICP-AES（Optima 2000DV）：珀金埃爾默儀器（上海）有限公司；亞碲酸鈉（Na2TeO3）為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 小球藻培養(yǎng)

試驗(yàn)容器500 mL三角瓶，培養(yǎng)體積200 mL，培養(yǎng)溫度 30 ℃，光照周期 14 h∶10 h，光照強(qiáng)度 4000 lx，將C.vulgaris的初始培養(yǎng)密度調(diào)為A540為0.1～0.2，置于光照培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。每天定時(shí)搖勻3次。

1.2.2 Te（IV）脅迫試驗(yàn)

某碲處理組某一時(shí)刻的碲劑量χTe，定義為該時(shí)刻體系中碲總量CTe與該時(shí)刻相應(yīng)的生物量W的比值，

設(shè)定碲處理組Ⅰ～V 的 χTe分別為 0.25、0.50、0.75、1.00，并在生長(zhǎng)周期的第7、8、9三天維持每天相同的碲劑量水平，按由式(1)確定Te(IV)的添加量。各組第n天的碲總量為Cn=Wn·χTe，每天測(cè)定藻體吸收轉(zhuǎn)化的碲有一定的難度，則體系中的碲總量近似為累計(jì)加碲量。因此，各試驗(yàn)組第 n d 應(yīng)添加的碲量為 Cn－Cn－1，即 Wn·χTe－Cn－1·χTe（n=1,2,…，10）。具體加碲量由每天的生物量W來(lái)定。不加Te（IV）的為對(duì)照組（CK）。

1.3 測(cè)定方法

1.3.1 生物量的測(cè)定

每天同一時(shí)間用分光光度計(jì)測(cè)定C.vulgaris培養(yǎng)液在540 nm處的吸光值（A540），重復(fù)3次取平均值。以11天為一個(gè)生長(zhǎng)周期，以時(shí)間T（d)為橫坐標(biāo)，A值為縱坐標(biāo)，繪制生長(zhǎng)曲線(xiàn)。以第11天采收的C.vulgaris的干重來(lái)表示最終生物量。用式（2）將第7、8、93天藻液的A540換算成生物量W（g/L），用于確定Te（IV）的添加量。

1.3.2 粗酶液的提取

各試驗(yàn)組的C.vulgaris培養(yǎng)至第11天，取30 mL藻液，用0.45 μm微孔濾膜抽濾，藻泥懸浮于10 mL 50 mmol/L的磷酸緩沖溶液PBS（pH 7.8），于冰浴中超聲波破碎10 min（超聲時(shí)間5 s，時(shí)間間隔5 s），離心，上清液為粗酶液。

1.3.3 抗氧化酶活性的測(cè)定

超氧化歧化酶（SOD）活性的測(cè)定參照Beauchamp等[12]建立，Bewley等[13]改進(jìn)的氮藍(lán)四唑（NBT）光化學(xué)還原反應(yīng)法。

1個(gè)SOD活力單位定義為能引起反應(yīng)初速度 (指不加酶時(shí))半抑制時(shí)的酶用量，按下式求得：

過(guò)氧化氫酶 (CAT)活性的測(cè)定參照Chance和Maehly[14]的方法，以每分鐘A240下降0.01為1個(gè)CAT活力單位（U）。

抗壞血酸過(guò)氧化物酶（APX）活性的測(cè)定參照文獻(xiàn)[15]的方法，以每分鐘氧化1 μmol抗壞血酸的酶量為1個(gè)APX活力單位（U）。

可溶性蛋白含量用考馬斯亮藍(lán)法[16]測(cè)定。酶活力以每毫克蛋白計(jì)(U/mg protein)。

1.3.4 碲含量的測(cè)定

藻體總碲、無(wú)機(jī)碲及有機(jī)碲測(cè)定：取培養(yǎng)至11 d的藻液15 mL，用0.45 μm的濾膜過(guò)濾，雙蒸水洗滌，藻泥加入混酸（HNO3∶HClO3=3∶1）消化至無(wú)色透明，用雙蒸水定容至10 mL，適當(dāng)稀釋后，用ICP－AES法測(cè)定藻體總碲。另取30 mL的藻液過(guò)濾，雙蒸水洗滌，藻泥加入15%HCl，沸水加熱10 min，用HCl定容至5 mL，過(guò)濾，取濾液用ICP－AES測(cè)定無(wú)機(jī)碲。有機(jī)碲以藻體總碲和無(wú)機(jī)碲之差計(jì)算。

培養(yǎng)液總碲的測(cè)定：取上述濾液1 mL，加5 mL混酸消化，用雙蒸水定容至10 mL，適當(dāng)稀釋后用ICPAES測(cè)總碲含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同富碲劑量組的C.vulgaris的生長(zhǎng)情況

不同碲劑量（χTe）對(duì)C.vulgairs生長(zhǎng)的影響情況見(jiàn)圖1；不同碲劑量（χTe）對(duì)C.vulgairs最終生物量和水溶性蛋白含量的影響見(jiàn)圖2、3。由圖1可知，對(duì)照組與各碲處理組之間C.vulgairs的生長(zhǎng)均無(wú)顯著性差異（P＞0.05)。第 7 天加碲后，χTe＝0.75、1.00 組 C.vulgaris的生長(zhǎng)受到一定抑制，且這種抑制作用隨χTe的增加而增大（第 8天的生長(zhǎng)速率分別為-0.0015 h-1、-0.0029 h-1）。第9天加碲完畢，9 d~11 d各碲處理組的生長(zhǎng)速率均大于對(duì)照組，且Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組有明顯的增大。其原因一方面是由于第10天開(kāi)始，由于C.vulgaris生物量的增加，單位生物量上的碲濃度即χTe下降，對(duì)藻體的脅迫作用減弱；另一方面體現(xiàn)了C.vulgaris對(duì)加碲處理具有較強(qiáng)的適應(yīng)性和自我修復(fù)功能。由圖2、圖3可知，碲處理組C.vulgaris的最終生物量和水溶性蛋白含量均大于對(duì)照組。其中，最終生物量隨著χTe的增大呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)，在χTe為0.75時(shí)達(dá)到最大值0.838 g/L，比對(duì)照組增加了21%；水溶性蛋白在χTe為1.00時(shí)達(dá)到最大，為314.7 mg/L，較對(duì)照組高出13.6%。但同時(shí)我們也注意到，水溶性蛋白的增加是由于生物量的積累，單位生物量上的蛋白含量在高χTe處理組中反而有下降的趨勢(shì)。由此可見(jiàn)，富碲處理有利于C.vulgaris生物量的積累和水溶性蛋白的合成，但表現(xiàn)為相對(duì)低χTe的強(qiáng)促進(jìn)作用和相對(duì)高χTe的弱促進(jìn)作用甚至是抑制作用，因此要嚴(yán)格控制劑量范圍。

2.2 對(duì)抗氧化酶系統(tǒng)的影響

環(huán)境脅迫能導(dǎo)致植物體內(nèi)產(chǎn)生過(guò)量的活性氧。植物為保證其正常的代謝機(jī)能，其體內(nèi)存在的抗氧化酶系統(tǒng)負(fù)責(zé)對(duì)活性氧進(jìn)行抵御和清除。不同碲劑量下的抗氧化酶活性的變化見(jiàn)表1。

表1 C.vulgaris各種抗氧化酶活性的變化Table 1 Changes of antioxidant enzymes of C.vulgaris

SOD是藻體內(nèi)O2－·的唯一清除劑，可以催化O2－·發(fā)生歧化反應(yīng)，生成H2O2和O2。隨著χTe的增大，藻體內(nèi)產(chǎn)生更多的O2－·，誘導(dǎo)了SOD活性的增加，使毒性大的O2－·及時(shí)轉(zhuǎn)化為毒性較小的H2O2。當(dāng)χTe大于0.75時(shí)，SOD活性低于對(duì)照組，表明此時(shí)部分SOD酶受到損傷。CAT和APX共同的作用底物是H2O2。隨著χTe的增大，這兩種酶的活性變化呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)的趨勢(shì)，且基本都大于對(duì)照組（除χTe為0.50時(shí)CAT活性略小于對(duì)照組）。表明在脅迫條件下，更多的O2－·轉(zhuǎn)化為H2O2，觸發(fā)了抗氧化機(jī)制，誘導(dǎo)了酶活性的增加，這也是C.vulgaris對(duì)碲有良好的耐受性的原因之一。3種抗氧化酶共同作用，對(duì)相對(duì)低劑量的處理組中產(chǎn)生的過(guò)量活性氧有良好的清除效果，保證了藻體正常的生長(zhǎng)和代謝。但當(dāng)χTe為1.00時(shí)，SOD活性明顯低于對(duì)照組，過(guò)多的O2－·將導(dǎo)致藻體部分代謝機(jī)能降低，不能保證良好的生長(zhǎng)狀態(tài)。這也與高劑量處理組C.vulgaris單位生物量的水溶性蛋白呈下降趨勢(shì)的現(xiàn)象相吻合。因此，進(jìn)行C.vulgaris的富碲培養(yǎng)時(shí)，碲劑量應(yīng)控制在1.00以?xún)?nèi)。

2.3 C.vulgaris對(duì)碲的吸收代謝

C.vulgaris對(duì)碲的吸收代謝情況見(jiàn)表2、表3。各碲處理組藻體中的總碲、無(wú)機(jī)碲、有機(jī)碲產(chǎn)量，以及培養(yǎng)液中的總碲均隨著χTe的增大而增大。碲在藻體中存在形式與χTe密切相關(guān)，隨著χTe增加，藻體碲產(chǎn)率增加但有機(jī)碲比率下降，后者在χTe為0.25時(shí)達(dá)到最大（58.9%）。可見(jiàn)低χTe有利于C.vulgaris中碲的有機(jī)化，高χTe有利于藻體中碲的產(chǎn)量和產(chǎn)率的提高。例如，當(dāng)χTe為1.00時(shí)可獲得碲含量高達(dá)67.79 mg/g的高富碲C.vulgaris，其中有機(jī)碲含量為18.62 mg/g。

表2 藻體碲含量和培養(yǎng)液碲含量Table 2 Te content in alga and culture medium

許多生物（包括微生物、動(dòng)物和人）可將吸收到體內(nèi)的無(wú)機(jī)碲轉(zhuǎn)化為氣態(tài)碲[17]，氣態(tài)碲的主要形式有二甲基碲（DMTM）和二甲基二碲（DMDTe）。生物體內(nèi)碲的甲基化反應(yīng)是一個(gè)重要的生物有機(jī)化過(guò)程，被認(rèn)為是生物體內(nèi)的解毒方式之一[17]。藻細(xì)胞將代謝產(chǎn)生的碲以氣態(tài)的形式排出體外，可以避免過(guò)量的碲對(duì)藻細(xì)胞的毒害作用。如表3所示，在本試驗(yàn)中，各碲處理組的氣態(tài)碲產(chǎn)率均為50%左右，隨χTe增加呈現(xiàn)先減小后增加的趨勢(shì)。低χTe時(shí)，C.vulgaris生長(zhǎng)狀況良好，藻體對(duì)碲的吸收代謝旺盛，培養(yǎng)基中的無(wú)機(jī)碲通過(guò)C.vulgaris的甲基化作用轉(zhuǎn)化為氣態(tài)碲并排出藻體外；當(dāng)χTe較高時(shí)，培養(yǎng)基中的碲超出C.vulgaris的耐受能力，所以更多的碲被藻細(xì)胞以氣態(tài)形式排出，以緩解碲對(duì)藻體的毒性。高比率的氣態(tài)碲的解毒機(jī)制和逆境條件下觸發(fā)的抗氧化酶系統(tǒng)的保護(hù)機(jī)制的共同作用確保了C.vulgaris良好的生長(zhǎng)狀況。

表3 C.vulgaris的碲代謝產(chǎn)物分布Table 3 Distributing of metabolic products of Te in C.vulgaris

3 結(jié)論

本試驗(yàn)在小球藻（C.vulgaris）生長(zhǎng)周期的第 7、8、9三天分次添加無(wú)機(jī)碲，維持碲劑量為0.25~1.00，進(jìn)行富碲培養(yǎng)。結(jié)果表明，此種方法培養(yǎng)的C.vulgaris生長(zhǎng)狀況良好。這一方面是由于C.vulgaris在逆境條件（無(wú)機(jī)碲的刺激）下觸發(fā)了抗氧化酶系統(tǒng)的保護(hù)機(jī)制，清除藻體內(nèi)過(guò)剩的自由基，從而使藻體保持良好的生長(zhǎng)狀態(tài)；另一方面，C.vulgaris通過(guò)甲基化作用，將培養(yǎng)基中過(guò)多的無(wú)機(jī)碲轉(zhuǎn)化為氣態(tài)碲排出體外，緩解了逆境環(huán)境對(duì)藻體的損傷。分次加碲法不僅能提高C.vulgaris的最終生物量、水溶性蛋白含量，且藻體碲產(chǎn)量可以高達(dá)67.79 mg/g，其中有機(jī)碲產(chǎn)量為18.62 mg/g，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于各種富硒、碲功能食品及保健品，但在分次加碲處理時(shí)應(yīng)嚴(yán)格控制劑量范圍在1.00以?xún)?nèi)，否則碲會(huì)對(duì)C.vulgaris的生長(zhǎng)產(chǎn)生不良影響。本試驗(yàn)所獲得的結(jié)果顯示，小球藻是一種良好的富碲生物載體，分次加碲法是小球藻高值化處理的有效途徑。

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Culture of High Tellyrium-Enriched Chlorella Vulgaris with a Stepwise Tellurium Addition Method and its Effects on the Antioxidant Enzymes of the Microalgae

JIANG Jie,CHEN Tian-feng,YANG Fang,ZHENG Wen-jie*
（Chemistry Department of Jinan University,Guangzhou 510632,Guangdong,China）

2010-07-10

國(guó)家自然科學(xué)基金 (20771044)；廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2008A030201020，2007B030703007)

蔣潔(1986—)，女（漢），碩士研究生，研究方向：生物無(wú)機(jī)。

*通信作者