劉亞,章超樺,陸子鋒

1(水產(chǎn)品深加工廣東普通高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東湛江,524088)

2(廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院廣東,湛江,524088)

高效液相色譜法檢測水產(chǎn)品中的ATP關(guān)聯(lián)化合物＊

劉亞1,2,章超樺1,2,陸子鋒2

1(水產(chǎn)品深加工廣東普通高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東湛江,524088)

2(廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院廣東,湛江,524088)

研究了利用高效液相色譜法對水產(chǎn)品中的ATP關(guān)聯(lián)化合物進(jìn)行檢測,確定了緩沖液的最佳pH值、流速和濃度,并對方法的準(zhǔn)確度、精確度和檢測限進(jìn)行了測定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:pH值6.5,流速0.70 mL/min時色譜峰的分離情況較好。7種ATP關(guān)聯(lián)化合物含量在2～500μg/mL時,濃度與色譜峰面積呈良好的線性關(guān)系。本方法的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.08%～6.81%,加標(biāo)平均回收率為98.11%～102.25%。方法檢出限為52～53 ng/mL。

高效液相色譜,ATP關(guān)聯(lián)化合物,測定

ATP關(guān)聯(lián)化合物是由嘌呤堿基、嘧啶堿基、尼克酰胺等與糖磷酸酯組成的一類化合物,如鳥苷酸(GMP)、肌苷酸(IMP)、三磷酸腺苷(ATP)、二磷酸腺苷(ADP)、一磷酸腺苷(AMP)、次黃嘌呤核苷(Hx)和次黃嘌呤(HxR)等。它們與水產(chǎn)原料的風(fēng)味和新鮮度緊密相關(guān)[1]。如AMP有著壓抑苦味的特性,能使食物產(chǎn)生理想的甜味和咸味,是貝肉中良好的風(fēng)味增強(qiáng)劑。而與AMP所產(chǎn)生的鮮味相反,ATP降解的一種最終產(chǎn)物——次黃嘌呤會產(chǎn)生苦味[2]。肌苷酸(IMP)、鳥苷酸(G MP)是主要的呈味核苷酸,作為新型的食品添加劑,已逐漸廣泛應(yīng)用于食品調(diào)味中[3]。MP增加食品鮮味的能力比谷氨酸鈉強(qiáng)40倍,它與味精合用具有協(xié)同作用,含2%～8%肌苷酸的味精通常稱為強(qiáng)力味精[4]。

對ATP關(guān)聯(lián)化合物的檢測方法種類較多,而高效液相色譜法相對于化學(xué)滴定法、紫外比色法、液相色譜離子交換法等,具有前處理簡單、干擾小、靈敏度高、分析快速的特點(diǎn)[5-7]。本研究對液相色譜檢測條件中流動相的最佳pH值、濃度和流速等進(jìn)行實(shí)驗(yàn),并對方法的準(zhǔn)確度和精確度進(jìn)行了檢驗(yàn),建立了適合水產(chǎn)品中ATP關(guān)聯(lián)化合物檢測的HPLC方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料

馬氏珠母貝肉,購于廣東湛江東風(fēng)市場,去殼,采肉,于-20℃冷藏備用。沙蟲干和元貝干,均購于廣東湛江沃爾瑪超市。

1.1.2 試劑

肌苷酸、鳥苷酸、三磷酸腺苷、二磷酸腺苷、一磷酸腺苷、次黃嘌呤核苷和次黃嘌呤標(biāo)準(zhǔn)品:Sigma公司,含量≥99.0%;甲醇,色譜純;磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、高氯酸、磷酸和氫氧化鉀均為分析純;6%高氯酸,于4℃冰箱冷藏備用;實(shí)驗(yàn)用水均為超純水。

1.1.3 儀器與設(shè)備

LC-20AD高效液相色譜儀,日本SHIMADZU公司;COS MOS IL 5C18-MS-II型HPLC色譜柱,日本Nacalai Tesque公司;UV-2550型紫外分光光度計(jì),日本SHIMADZU公司;HR 1727型攪拌機(jī),珠海飛利浦家庭電器有限公司;HIMAC CR22GII型冷凍離心劑,日本H ITACH I公司;PHSJ-4A型pH計(jì),上海精密科學(xué)儀器有限公司;SB-5200型超聲波清洗器,上海新芝生物技術(shù)研究所;SHZ-D(Ⅲ)型循環(huán)水式真空泵,鞏義市予華儀器有限公司;LD-100G-C型超純水機(jī),重慶利迪現(xiàn)代水技術(shù)設(shè)備有限公司,以及其他實(shí)驗(yàn)室常規(guī)儀器。

實(shí)驗(yàn)用玻璃儀器用超聲波清洗器水浴振蕩30 min,用自來水反復(fù)沖洗,再用超純水淋洗3～4遍,晾干備用。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品處理[8-9]

精確稱取樣品(濕樣5 g,干樣1 g),加入30 mL 6%冷高氯酸,濕樣勻漿,干樣放入裝有冷水的容器超聲振蕩5 min,4℃10000 r/min離心20 min,取上清液,用KOH調(diào)節(jié)pH值至6.5,沉淀重復(fù)提取一次,合并上清液。置于2℃冰箱靜置30 min,取上清液用0.45μm微孔濾膜過濾,所得濾液用pH值6.5的高氯酸定容至100 mL。4℃保存?zhèn)溆?。上機(jī)檢測前用0.22μm的微孔濾膜過濾。

1.2.2 色譜條件[8]

流動 相:流 動 相 A(0.05 mol/L KH2PO4-K2HPO4);流動相B為V(0.05 mol/L KH2PO4-K2HPO4)∶V(甲醇)=9∶1,pH值均為6.5,均用0.45μm的微孔濾膜過濾。

洗脫條件:二元梯度洗脫,梯度洗脫程序?yàn)?1～14 min為流動相A洗脫,14～18 min時流動相B按直線斜率上升至25%,18～22 min時流動相B上升至90%,22～25 min時過渡到用100%流動相B進(jìn)行洗脫,流速0.7 mL/min,進(jìn)樣量10μL,檢測波長254 nm。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制[8]

分別準(zhǔn)確稱取鳥苷酸、肌苷酸、三磷酸腺苷、二磷酸腺苷、一磷酸腺苷、次黃嘌呤核苷和次黃嘌呤標(biāo)準(zhǔn)品0.0050 g,用超純水溶解并混合定容于50 mL容量瓶中,成為混合標(biāo)準(zhǔn)。上機(jī)前再用0.22μm的微孔濾膜過濾。

1.2.4 計(jì)算公式

式中:WS,標(biāo)準(zhǔn)樣品核苷酸的實(shí)測含量,mg/kg;AS,標(biāo)準(zhǔn)峰的面積;A,樣品峰的面積。

2 結(jié)果與分析

2.1 流動相pH值對ATP關(guān)聯(lián)物標(biāo)準(zhǔn)的色譜分離情況的影響

在混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中,各標(biāo)準(zhǔn)物之間的分離度可以作為分離效果優(yōu)劣的判斷,流動相pH值的變化直接影響分離效果。在使用同一色譜柱和磷酸鹽濃度相同的流動相并采用同樣的進(jìn)樣量情況下,配制pH值分別為4.0、4.5、5.0、5.5、6.5、7.5的流動相,進(jìn)行色譜分析。色譜圖見圖1。

當(dāng)分離度為1.0時,分離程度可以達(dá)到98%,分離度為1.5時,分離程度可達(dá)99.7%,以分離度為1.5作為相鄰2峰已完全分開的標(biāo)志。5種pH值條件下7個峰的分離度結(jié)果見表1。

圖1 不同流動相pH值對ATP關(guān)聯(lián)化合物的色譜分離情況比較

表1 不同pH的流動相對ATP關(guān)聯(lián)化合物分離效果的影響

由圖1和表1可知,當(dāng)pH值為5.5和7.5時,7個峰不能完全分離。當(dāng)pH值分別為4.0、4.5、5.0、和6.5時,在pH值較低條件下,峰形較差;隨著pH值增大,峰形明顯變好。對比7個標(biāo)準(zhǔn)物的分離情況,當(dāng)pH為6.5時,各個峰的分離狀況良好,峰形較好,說明pH在6.5左右流動相擁有良好的洗脫能力,使7種化合物具有不同的極性,便于洗脫分離。

2.2 流動相磷酸鹽濃度對ATP關(guān)聯(lián)物標(biāo)準(zhǔn)的色譜分離情況的影響

分別配制0.01、0.02L、0.03、0.04L、0.05和0.06 mol/L的KH2PO4-K2HPO4緩沖液A和B,考察在不同磷酸鹽濃度的情況下的洗脫情況。色譜圖見圖2。

由圖2可知,流動相濃度在0.01～0.03 mol/L時,出峰時間相對較長,峰形較差,有的峰還有明顯的拖尾現(xiàn)象;隨著濃度的提高,在0.04～0.06 mol/L時,7種標(biāo)準(zhǔn)物可以得到較好的分離,出峰時間穩(wěn)定,保留時間變短。這可能由于隨磷酸鹽濃度的增加,較高濃度的流動相掩蔽C18反相色譜柱硅羥基的二次作用而減少了拖尾。由于較高的磷酸鹽緩沖液濃度對色譜柱有較大的傷害,因此本實(shí)驗(yàn)選用0.05 mol/L的緩沖液濃度作為流動相濃度。

圖2 不同磷酸鹽濃度對ATP關(guān)聯(lián)物標(biāo)準(zhǔn)的色譜分離情況的比較

2.3 流動相不同流速對ATP關(guān)聯(lián)物標(biāo)準(zhǔn)的色譜分離情況的影響

分別以0.3、0.5、0.7、0.9、1.1mL/min的流速進(jìn)行分離,分離情況見圖3。

圖3 不同流速對ATP關(guān)聯(lián)物標(biāo)準(zhǔn)的色譜分離情況比較

由圖3可知,隨著流速的增大,總體洗脫時間明顯減少,但過快的流速會造成泵壓增大。從出峰時間和峰形來看,選用0.7 ml/min的流速來進(jìn)行洗脫,峰形較高較尖,泵壓適宜,總體耗時在35 min之內(nèi)。

圖4為最優(yōu)條件下ATP關(guān)聯(lián)化合物的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)圖譜。

圖4 ATP關(guān)聯(lián)化合物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)圖譜

圖4 為7種ATP關(guān)聯(lián)化合物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的高效液相色譜圖,本色譜條件下在35 min之內(nèi)7種化合物得到了有效分離,且重現(xiàn)性好。其出峰順序以時間由快到慢分別為G MP,IMP,ATP,ADP,Hx,AMP,HxR。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢測限

將混和標(biāo)準(zhǔn)溶液分別配制成2、10、20、50、100、500μg/mL標(biāo)液,進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定,實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 ATP關(guān)聯(lián)化合物標(biāo)準(zhǔn)曲線方程和相關(guān)系數(shù)

由表2可知,在2～500μg/mL內(nèi),7種ATP關(guān)聯(lián)化合物的濃度和面積均具有良好的線性關(guān)系。

檢出限是3倍空白值的標(biāo)準(zhǔn)偏差相對應(yīng)的質(zhì)量或濃度。色譜儀的最低響應(yīng)值S=3N,N為儀器的噪音水平,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在樣品中被測組分峰高為基線噪音3倍時的檢出限值見表3。

表3 檢測方法的最低檢測限 ng/mL

2.5 實(shí)驗(yàn)方法的精確度和準(zhǔn)確度

取30、40、50、100μg/mL ATP關(guān)聯(lián)化合物的標(biāo)準(zhǔn)溶液,每個濃度連續(xù)進(jìn)樣5次,測得精確度結(jié)果。

配制未知濃度的樣品,以其作為1.0×使用液,分別取使用液5.0、7.0,加入10 mL容量瓶,用超純水定容至10 mL,得到0.5×、0.7×和1.0×3個未知濃度的使用液;再分別取1.0×、0.7×、0.5×使用液5.0 mL,加入已知濃度的100μg/mL核苷酸混合標(biāo)準(zhǔn)液5.0 mL,混合均勻,超聲波清洗機(jī)振蕩5 min,用0.22μm微孔濾膜過濾,分別對3種未知濃度的使用液和已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)液上機(jī)測試,測定準(zhǔn)確度的結(jié)果。精確度和準(zhǔn)確度結(jié)果見表4。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,5次平行測定值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.08%～6.81%;加標(biāo)回收率為98.11%～102.25%之間,其精確度和準(zhǔn)確度測試均符合GB/T27404-2008標(biāo)準(zhǔn)[10]。

表4 實(shí)驗(yàn)方法的精確度和準(zhǔn)確度結(jié)果

2.8 樣品的測定結(jié)果

準(zhǔn)確稱取馬氏珠母貝肉、沙蟲干粉、元貝粉按照

1.2.1 方法處理,各種樣品測試結(jié)果見表5。

表5 三種樣品的色譜測試結(jié)果(n=2) mg/kg

ATP及其降解產(chǎn)物的含量主要取決于其降解途徑和所處的降解階段。海產(chǎn)動物ATP的降解有2條途徑[1,11]:(1)ATP→ADP→AMP→AdR→HxR→Hx;(2)ATP→ADP→AMP→ IMP→HxR→Hx。若通過途徑(1)降解則AMP容易積累,以途徑(2)降解,則MP更容易積累。一般認(rèn)為途徑(1)為軟體動物的核苷酸代謝途徑,(2)為魚類代謝途徑。本研究在馬氏珠母貝中檢出較高含量的AMP和 IMP,說明馬氏珠母貝中ATP的降解以途徑(1)為主;同時也存在降解途徑(2)。

鮮活質(zhì)量指標(biāo)K值是反映水產(chǎn)品初期鮮度變化以及與品質(zhì)風(fēng)味有關(guān)的生化質(zhì)量指標(biāo)。一般采用K值≤20%作為優(yōu)良鮮度指標(biāo)(日本用于生食魚肉的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)),K值≤60%作為加工原料的鮮度標(biāo)準(zhǔn)[1]。測定其最終分解產(chǎn)物(次黃嘌呤核苷和次黃嘌呤)所占總的ATP關(guān)連物的百分?jǐn)?shù)即為鮮度指標(biāo)K值,可用下式表示:

K值越高,說明樣品的核苷酸鮮味成分越少,鮮度越差。按鮮度從優(yōu)到劣排序,元貝(1%)>沙蟲干(16%)>鮮馬氏珠母貝肉(79%)。馬氏珠母貝肉的鮮度較低,未達(dá)到作為加工原料的鮮度標(biāo)準(zhǔn)。

3 小結(jié)

選用ODS C18反相色 譜 柱,以 pH值 6.5、0.05mol/L的磷酸鹽緩沖液作為流動相,在254nm波長下檢測樣品中核苷酸關(guān)聯(lián)化合物的含量。該色譜分離條件分離7種ATP關(guān)聯(lián)化合物約需35min左右、分離效果好。經(jīng)過對該方法的精確度、回收率試驗(yàn)和樣品實(shí)際含量測定,結(jié)果表明該方法重現(xiàn)性良好,精確度高,能符合不同含量樣品的測定的要求。

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ABSTRACTIn this study,the detection method ofATP related compounds of fishery products by using HPLC was researched.The optimal conditions such as pH value,flow rate and concentration of mobile phase were deter mined.The accuracy,precision and limit of quantitation were surveyed and evaluated.The results showed thatwhen the pH value was at 6.5 and the flow rate 0.70 mL/min the seven chromatographic peakswerewell separated.When the concentration of sevenATP related compoundswere from 2μg/mL to 500μg/mL,the concentration of standard substance and peak area were kept good linear relationship.The RSD%is be tween 0.08%and 6.81%,the coefficient of recovery reached 98.11%～102.25%.The limitsof quantitationwere from 52ng/mL to 53ng/mL.According to the result thismethod was better to detecting the ATP related compounds of fishery products.

Key wordsHPLC,ATP related compounds,determination

Detection of ATP Related Compounds of Sea Food by HPLC

Liu Ya1,2,Zhang Chao-hua1,2,Lu Zi-feng2
1(Key Laboratory ofAquatic Product Advanced Processing of Guangdong Higher Education Institutes,Zhangjiang 5240088,China)
2(College of Food Science&Technology,GuangdongOcean University,Zhanjiang 524088,China)

在讀博士(章超樺教授為通訊作者,E-mail:zhangch@gdou.edu.cn)。

＊農(nóng)業(yè)部“948項(xiàng)目”(No.2006 G42);國家科技支撐計(jì)劃(No.2007BAD29B00)

2010-02-23,改回日期:2010-05-05