呂旭聰,黃志清,黃若蘭,黃彬紅,饒平凡,倪莉

(福州大學(xué),食品科學(xué)與技術(shù)研究所,福建福州,350108)

反相高效液相色譜法同時(shí)快速測(cè)定黃酒和葡萄酒中有機(jī)酸的含量＊

呂旭聰,黃志清,黃若蘭,黃彬紅,饒平凡,倪莉

(福州大學(xué),食品科學(xué)與技術(shù)研究所,福建福州,350108)

建立了利用反相高效液相色譜法同時(shí)快速測(cè)定黃酒和葡萄酒中酒石酸、甲酸、蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸等 7 種有機(jī)酸的方法。采用的色譜柱為 X B-C18(5μm,150 mm×4.6 mm),檢測(cè)器為紫外檢測(cè)器,波長(zhǎng)210 nm;確定的最優(yōu)色譜條件是:0.02 mol/L KH2PO4-乙腈(98∶2),pH 2.3,流速1.0 mL/min,柱溫30℃,進(jìn)樣量10.0μL,沖洗方式為等度洗脫。利用此方法分析測(cè)定有機(jī)酸的工作曲線線性關(guān)系良好,回收率在83.17%～117.3%,變異系數(shù)在3.1%～5.8%。利用研究所構(gòu)建的反相高效液相色譜法能夠快速地對(duì)黃酒和葡萄酒中的有機(jī)酸進(jìn)行測(cè)定,滿足企業(yè)對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控。

反相高效液相色譜法(RP-HPLC),同時(shí)分析測(cè)定,黃酒,葡萄酒,有機(jī)酸

在食品工業(yè)中,不少食品和飲料都與有機(jī)酸有關(guān),這些有機(jī)酸和其他香味成分一起,賦予了食品一定的口感。俗話說(shuō):“無(wú)酸不成酒”,說(shuō)明酸在酒中有著重要的作用[1-4]。實(shí)際上酸是酒體的重要組成部分,同時(shí)各種有機(jī)酸又是酒產(chǎn)香的前體物質(zhì):酸能有效增強(qiáng)酒的濃厚感,降低甜度,并且具有緩沖、協(xié)助其他香味成分的作用[5-6]。然而,酒中有機(jī)酸種類和含量也并不是越多越好,因此有必要構(gòu)建一種快速分析酒中有機(jī)酸含量的方法。

有機(jī)酸的檢測(cè)方法有很多種[7-10],但是這些方法一般要進(jìn)行預(yù)分離、衍生化等繁瑣的前處理,而且能達(dá)到同時(shí)分離的有機(jī)酸種類較少,目前最為成熟的技術(shù)就是高效液相色譜技術(shù)。近些年利用高效液相色譜法測(cè)定有機(jī)酸的報(bào)道較多[11-13],研究大多利用高效液相色譜法測(cè)定葡萄酒中的有機(jī)酸含量[14-15]。反相高效液相色譜法(RP-HPLC)廣泛用于測(cè)定有機(jī)酸,不僅簡(jiǎn)單快速,且選擇性好,準(zhǔn)確度高。試驗(yàn)中采用反相高效液相色譜替代離子交換色譜同時(shí)分離7種有機(jī)酸,對(duì)包括流動(dòng)相的組成、流動(dòng)相pH等對(duì)分離效果具有影響的參數(shù)等進(jìn)行了優(yōu)化,建立了適合有機(jī)酸分離的優(yōu)化參數(shù),并對(duì)幾種黃酒和葡萄酒中有機(jī)酸的類型及含量進(jìn)行定性、定量分析。

1 材料與方法

1.1 材料

國(guó)優(yōu)名酒“鼓山”福建老酒、古越龍山陳年花雕、3年陳會(huì)稽山紹興花雕酒、惠澤龍印象閩派黃酒(3年)、惠澤龍閩派黃酒(10年)、青紅酒、閩樂(lè)青酒、閩樂(lè)紅8年花雕黃酒、長(zhǎng)城干白葡萄酒(2000年)、張?jiān)＞犯杉t葡萄酒(1995年)。以上產(chǎn)品均為市售產(chǎn)品。

1.2 儀器與試劑

儀器:日本島津LC-3A型高效液相色譜儀;XBC18色譜柱;SPD-1紫外分光光度檢測(cè)器;PB303-E電子天平(梅特勒-托利多儀器公司);pHB-3便攜式pH計(jì)(上海偉業(yè)儀器廠);SHZ-D(Ⅲ)型循環(huán)水真空泵(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司);5415R型臺(tái)式高速離心機(jī)(eppendorf公司)。

試劑:標(biāo)準(zhǔn)品酒石酸、甲酸、蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸均為國(guó)產(chǎn)分析純;磷酸二氫鉀和磷酸為分析純;配制試劑所用的水為經(jīng)Milli-QⅡ純水處理裝置處理過(guò)的超純水。

有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)液的制備:酒石酸 0 .5000 g,蘋果酸0.5000 g,檸檬酸 0 .5000 g,琥珀酸0.5000 g,甲酸0.44 mL,乙酸0.5000 mL,乳酸0.425 mL定容于100 mL容量瓶中,所配溶液均經(jīng) 0 .45μm微孔濾膜過(guò)濾,水為超純水。

1.3 色譜分析條件

色譜柱:XB-C18,5μm,150 mm×4.6 mm;流動(dòng)相為0.02 mol/L KH2PO4-乙腈(98∶2),用磷酸調(diào)pH值至2.3;流速1.0 mL/min;紫外檢測(cè)波長(zhǎng):210 nm;柱溫:30℃;進(jìn)樣量:10.0μL,沖洗方式為等度洗脫,峰面積用外標(biāo)法定量。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

為考察檢測(cè)波長(zhǎng)對(duì)有機(jī)酸檢測(cè)靈敏度的影響,用190～400 nm紫外光對(duì)草酸、酒石酸、蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸及琥珀酸分別進(jìn)行掃描,各酸在210 nm左右均有較大吸收峰,最大吸收波長(zhǎng)均在210 nm左右,所以把檢測(cè)波長(zhǎng)暫定在210 nm。

1.4.2 有機(jī)酸的分離

在反相C18柱上以KH2PO4-H3PO4緩沖液為流動(dòng)相,觀察流動(dòng)相中KH2PO4濃度、流動(dòng)相pH值、流速對(duì)7種有機(jī)酸分離的影響,選擇適宜的分離條件,測(cè)定各有機(jī)酸的保留值。

1.4.3 樣品處理與分析

樣品預(yù)處理:取10 mL酒液,離心(10000 r/min,15 min)2次,除去水不溶物,然后用0.45μm孔徑的濾膜過(guò)濾即得到待測(cè)液。

1.4.4 定性與定量

在相同的色譜條件下,將樣品色譜圖與有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行對(duì)照,根據(jù)確定樣品中的各有機(jī)酸峰的保留時(shí)間來(lái)進(jìn)行定性。還可以在樣品液中加入一定量的有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)溶液,觀察在相同的保留時(shí)間下,峰高是否增加,以此來(lái)進(jìn)行定性分析;在標(biāo)樣與樣品進(jìn)樣量相同的情況下,應(yīng)用外標(biāo)法定量,可計(jì)算出樣品中各有機(jī)酸的含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 HPLC色譜條件優(yōu)化

2.1.1 流動(dòng)相的選擇

常 用 的 緩 沖 液 以 KH2PO4、NaH2PO4及(NH4)2HPO4居多,這3種緩沖溶液均可成功實(shí)現(xiàn)復(fù)雜體系有機(jī)酸的分離,此外也有采用H2SO4溶液分離有機(jī)酸的報(bào)道。本研究選擇濃度為0.02 mol/L的磷酸二氫鉀-乙腈(98∶2)pH值2.3和0.005 mol/L的H2SO4溶液pH值2.0為流動(dòng)相,對(duì)7種有機(jī)酸混合標(biāo)準(zhǔn)樣進(jìn)行分離,分離圖譜見(jiàn)圖1和圖2。試驗(yàn)結(jié)果表明,采用0.02 mol/L的磷酸二氫鉀-乙腈(98∶2)作為有機(jī)酸分離的流動(dòng)相分離效果較好,圖1中有機(jī)酸的出峰順序是:酒石酸、甲酸、蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸。而采用pH值2.0的0.005 mol/L H2SO4溶液為流動(dòng)相時(shí),有機(jī)酸出峰明顯少,而且峰形不對(duì)稱,甚至峰與峰之間沒(méi)有達(dá)到基線分離,無(wú)法進(jìn)行定性定量分析,這可能跟色譜柱的類型及分離能力有一定的關(guān)系。

圖1 七種有機(jī)酸標(biāo)樣的色譜圖

圖1有機(jī)酸的出峰順序能夠與理論相吻合[16],在RP-HPLC中,被分離組分極性越弱,與鍵合相表面烷基之間色散力就越強(qiáng),容量因子K就越大。相反,極性越強(qiáng),即分子含羥基數(shù)和羧基數(shù)越多,與流動(dòng)相溶劑分子形成的氫鍵就越強(qiáng),K就越小。檸檬酸和琥珀酸都含有2個(gè)可與鍵合相表面烷基產(chǎn)生色散力的亞甲基,且檸檬酸的亞甲基的2個(gè)亞甲基被帶有部分正電荷的碳原子隔開(kāi),故其烷基間的色散力小于琥珀酸,故實(shí)際K的順序?yàn)?酒石酸<甲酸<蘋果酸<乳酸<乙酸<檸檬酸<琥珀酸。

圖2 七種有機(jī)酸在流動(dòng)相為0.005 mol/L H2SO4溶液(pH值2.00)的色譜圖

2.1.2 流動(dòng)相最佳pH值

流動(dòng)相的pH值對(duì)各種有機(jī)酸的分離效果具有十分重要的作用。所謂離子抑制法就是,在較低的pH值抑制酒中有機(jī)酸的電離,其大多數(shù)有機(jī)酸以有機(jī)酸分子的形式存在于酒中,從而使其能在C18柱中有較好的保留。流動(dòng)相pH值選擇的原則一般根據(jù)有機(jī)酸的pKa值來(lái)定。酒中的有機(jī)酸均為弱酸,在水溶液中存在著解離平衡,解離程度受溶液pH值的影響。考慮到色譜柱要求使用的流動(dòng)相pH值范圍為2.0≤pH≤9.0,將緩沖液的pH分別用磷酸調(diào)至2.0,2.3,2.5和2.8,經(jīng)4種不同流動(dòng)相進(jìn)行分離。結(jié)果表明,隨著pH值的增大,各有機(jī)酸的保留時(shí)間減少了,特別是出峰比較后面的檸檬酸和琥珀酸隨著pH增大,保留時(shí)間減少得比其他幾個(gè)有機(jī)酸明顯。有報(bào)道,提高H+濃度可抑制有機(jī)酸的解離,改變峰形。通過(guò)比較標(biāo)準(zhǔn)樣在不同pH值下的分離色譜圖以及酒樣在不同pH下的譜圖,最終選擇pH2.3為最佳的pH。

2.1.3 其他分離條件的選擇

美國(guó)安捷倫公司提供的Zorbax SB-C18(250×4.6 mm 5μm)色譜柱、Zorbax Extend-C18(250×4.6 mm5μm)色譜柱、Eclipse XDB-C18(250×4.6 mm 5μm)色譜柱都能用于有機(jī)酸的色譜分離。根據(jù)本研究條件,選擇Zorbax SB-C18(250×4.6 mm 5μm)色譜柱,波長(zhǎng)210 nm,流速1.0 mL/min,柱溫30℃,進(jìn)樣量10.0 μL,沖洗方式為等度洗脫。

2.2 有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取一定量的酒石酸、甲酸、蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸及琥珀酸,用超純水配成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)有機(jī)酸混合溶液。進(jìn)樣10μL,分別進(jìn)行HPLC分析。通過(guò)線性回歸處理峰面積y和有機(jī)酸含量x(g/100 mL)得回歸方程(表1),相關(guān)系數(shù)除酒石酸為0.9983外,其余均在0.999以上,表明線性關(guān)系良好。

表1 各種有機(jī)酸的工作曲線及線性相關(guān)性

2.3 檢測(cè)方法的評(píng)價(jià)

2.3.1 方法的回收率

將閩樂(lè)8年花雕黃酒酒樣以體積比1∶1加入含有酒石酸、甲酸、蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸的標(biāo)準(zhǔn)液,混合均勻,進(jìn)樣測(cè)定其含量,結(jié)果見(jiàn)表2?；厥章?%=(樣品加標(biāo)后測(cè)得量-樣品本底值)/標(biāo)樣加入量。結(jié)果表明,回收率在83.17%～117.3%,方法的準(zhǔn)確度較高。由于黃酒酒樣中酒石酸含量較低,而且在色譜圖上出峰不明顯,因此沒(méi)有計(jì)算酒石酸的回收率。

表2 有機(jī)酸測(cè)定方法的回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.3.2 方法的重現(xiàn)性

將閩樂(lè)紅酒樣重復(fù)進(jìn)樣測(cè)定4次,以考察方法的重現(xiàn)性。6種有機(jī)酸測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3,其中變異系數(shù)CV(%)=相對(duì)平均偏差(SD)/平均值(X),結(jié)果表明各種有機(jī)酸的變異系數(shù)在3.1%～5.8%,重現(xiàn)性較好。

表3 有機(jī)酸測(cè)定方法的重現(xiàn)性試驗(yàn)結(jié)果

2.4 酒樣中有機(jī)酸的測(cè)定

對(duì)不同的酒樣進(jìn)行分析測(cè)定,由于各種酒的釀造工藝不同,所采用的原料也有差異,故其中的有機(jī)酸含量也有差異,具體結(jié)果見(jiàn)表4。從表4可以看出,黃酒中乳酸和乙酸的含量相對(duì)較高,葡萄酒中酒石酸和蘋果酸的含量相對(duì)較高。圖3是長(zhǎng)城干白葡萄酒中有機(jī)酸的分離圖譜。酒樣的HPLC圖譜中出現(xiàn)那么多的峰的原因可能是酒中的β-苯乙醇、生物胺、氨基酸等出峰。本研究由于實(shí)驗(yàn)條件限制,對(duì)于一些峰未能進(jìn)行進(jìn)一步的定性定量分析。

表4 九種酒樣種有機(jī)酸的含量

圖3 白葡萄酒的分離譜圖

3 結(jié)論

采用高效液相色譜測(cè)定酒中的有機(jī)酸含量,確定了分離條件:色譜柱為XB-C18,5μm,150 mm×4.6 mm,紫外檢測(cè)器,波長(zhǎng)210 nm,流動(dòng)相為0.02 mol/L KH2PO4-乙腈(98∶2),pH值2.3,流速1.0 mL/min,柱溫30℃,進(jìn)樣量10.0μL,沖洗方式為等度洗脫。標(biāo)定了7種有機(jī)酸的濃度-峰高標(biāo)準(zhǔn)曲線,其相關(guān)系數(shù)在0.9983～0.9999。

在優(yōu)化的HPLC分析條件下,對(duì)市售的黃酒和葡萄酒中7種有機(jī)酸進(jìn)行了定量、定性,分別是酒石酸、甲酸、蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸。從測(cè)定的結(jié)果可以看出,黃酒中乳酸和乙酸在所測(cè)的7種有機(jī)酸中含量最高,葡萄酒中蘋果酸和酒石酸在所測(cè)的7種有機(jī)酸中含量最高,此法的回收率在83.17%～117.3%,變異系數(shù)在3.1%～5.8%?？疾斓挠袡C(jī)酸出峰時(shí)間都在6 min之內(nèi),能夠快速地對(duì)黃酒、葡萄酒中的有機(jī)酸進(jìn)行測(cè)定,滿足企業(yè)對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控的要求。

[1]高海燕,王善廣,胡小松.利用反相高效液相色譜法測(cè)定梨汁中有機(jī)酸的種類和含量[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2004,30(8):96-100.

[2]唐長(zhǎng)波,岳田利.色譜法分析食品中的有機(jī)酸[J].食品科技,2006(10):249-251.

[3]魏曉敏.食品中的酸味物質(zhì)[J].計(jì)量與測(cè)試技術(shù),2007,34(8):56-57.

[4]謝文逸.酒類酸度及有機(jī)酸分析進(jìn)展[J].釀酒科技,2002(2):81-82.

[5]李華.葡萄酒的總酸及pH值[J].釀酒,1987(6):9-12.

[6]馮向東.高效液相色譜法測(cè)定白酒中乳酸和乙酸含量[J].釀酒科技,2009(5):115-116.

[7]朱曉蘭,高蕓,蘇慶德.毛細(xì)管氣相色譜法測(cè)定番茄中的非揮發(fā)性有機(jī)酸、高級(jí)脂肪酸和低分子量糖類[J].食品科學(xué),2004,25(9):152-157

[8]田鵬,徐燁,鄧桂春,等.測(cè)定啤酒和葡萄酒中有機(jī)酸的離子排斥色譜法[J].分析測(cè)試學(xué)報(bào),2002,21(4):68-70.

[9]Ito K,Takayama Y,Ikedom,et al.Determination of some aliphatic carboxylic acids in anaerobic digestion process waters by ion-exclusion chromatography with conductimetric detection on aweakly acidic cation-exchange resin column[J].J Chromatogr:A,2004,1039(1/2):141-145.

[10]Tanaka K,Morim,Xu Q,et al.I on-exclusion chromatography with conductimetric detection of aliphatic carboxylic acids on a weakly acidic cation-exchange resin by elution with benzoic acid-β-cyclodextrin[J].J Chromatogr:A,2003,997(1/2):127-132.

[11]龐新安,萬(wàn)英.反相高效液相色譜法測(cè)定果品中有機(jī)酸[J].中國(guó)食物與營(yíng)養(yǎng),2007(11):40-41.

[12]Silvia Suarez-Luque,Ines Mato,Jose F.Huidobro,Jesus S imal-Lozano.Rapid deter mination of minority organicacids in honey by high-perfor mance liquid chromatography[J].Jounral of ChromatographyA,2002,955:207-214.

[13]趙景蟬,郭治安,常建華,等.有機(jī)酸類化合物的反相高效液相色譜法的分離條件研究[J].色譜,2001,19(3):260-263.

[14]高年發(fā),張軍,韓英素.高效液相色譜法測(cè)定葡萄酒中的有機(jī)酸[J].釀酒,2004,31(1):67-69.

[15]張軍,韓英素,高年發(fā).HPLC法測(cè)定葡萄酒中有機(jī)酸的色譜條件研究[J].釀酒科技,2004,122(2):91-93.

[16]向陽(yáng),李崎,顧國(guó)賢.國(guó)內(nèi)啤酒有機(jī)酸組成及其綜合評(píng)價(jià)[J].食品科學(xué),2007,28(1):266-269.

ABSTRACTThis paper established a method using RP-HPLC simultaneously and rapidly detecting of tartaric acid,for mic acid,malic acid,lactic acid,acetic acid,citric acid,succinic acid in rice wine and grape wine.The optimal separation conditions:the XB-C18(5μm,150mm×4.6mm)ultraviolet detector,wavelength 210 nm,mobile phase 0.02M KH2PO4-acetonitrile(98:2),pH 2.3,flow rate 1.0 ml/min,column temperature 30℃,injection of 10.0μl,Isocratic elution.The recovery rate ranged from 83.17 to 117.3%,and the relative standard deviations are 3.1%～5.8%.Reverse-phase high performance liquid chromatography can determine the organic acid in yellow rice wine and wine rapidly,which satisfy enterprises needs for real-t ime monitoring and quality control.

Key wordsreverse-phase,HPLC,s imultaneous determination,rice wine,wine organic acids

S imultaneousDeterm ination of Organic Acids in Wine with Reverse-phase High Performance L iquid Chromatography

Lv Xu-cong,Huang Zhi-qing,Huang Ruo-lan,Huang Bin-hong,Rao Ping-fan,NiLi
(Research Institute of Food Science and Technology,Fuzhou University,Fuzhou 350108,CHina)

博士(倪莉副教授為通訊作者,E-mail:nili@fzu.edu.cn)。

＊福建省高等學(xué)校新世紀(jì)優(yōu)秀人才支持計(jì)劃資助項(xiàng)目(No.S W2006-16),福建省教育廳資助項(xiàng)目(No.JA 07022),福建省自然科學(xué)基金計(jì)劃資助項(xiàng)目

2009-12-02,改回日期:2010-01-06