汪學(xué)榮,鄭炯,闞建全

1(西南大學(xué)動(dòng)物科學(xué)系,重慶,402460) 2(西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院,重慶,400715)

豬血多肽鐵螯合鹽的制備工藝＊

汪學(xué)榮1,鄭炯2,闞建全2

1(西南大學(xué)動(dòng)物科學(xué)系,重慶,402460) 2(西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院,重慶,400715)

研究了豬血多肽與鐵鹽進(jìn)行螯合反應(yīng)的條件,并測(cè)定了豬血多肽鐵螯合鹽的成分。試驗(yàn)表明:氯化亞鐵適合作為多肽與鐵進(jìn)行螯合反應(yīng)的鐵源,豬血多肽鐵螯合鹽的最佳制備工藝條件為,pH值5、多肽與亞鐵鹽質(zhì)量比4∶1、多肽溶液濃度3.0%,豬血多肽鐵螯合鹽的主要成分是多肽和鐵,其質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為70.02%和12.23%。

豬血多肽,鐵,螯合鹽,制備

鐵是生物體必需的重要營(yíng)養(yǎng)元素,缺鐵會(huì)產(chǎn)生多種疾病。WHO報(bào)道,世界上男性缺鐵性貧血的平均發(fā)病率為10%,女性為20%,孕婦達(dá)40%,兒童高達(dá)52%。我國(guó)各類(lèi)人群缺鐵性貧血的平均發(fā)病率為20%,其中婦女和兒童的發(fā)病率較高,育齡婦女缺鐵性貧血的發(fā)病率高達(dá)35%,兒童為30%～50%。為了防止缺鐵性貧血的發(fā)生,就需要經(jīng)常從食物中補(bǔ)鐵。目前補(bǔ)鐵劑主要有無(wú)機(jī)鐵、有機(jī)鐵、氨基酸鐵和生物鐵四類(lèi)。早在20世紀(jì)70年代,有研究者發(fā)現(xiàn)氨基酸和小肽具有促進(jìn)鐵吸收的作用[1-2],并且氨基酸和肽的金屬螯合物具有吸收率高,口感好,無(wú)鐵銹味,無(wú)胃腸道刺激,添加到食品中不影響食品性質(zhì),而且不易分解等優(yōu)點(diǎn),因此研究具有雙重功能的補(bǔ)鐵劑——多肽鐵螯合鹽具有十分重要的意義。有研究者對(duì)脫脂豆粕多肽、酪蛋白酶解多肽、低值魚(yú)蛋白多肽與鐵離子進(jìn)行螯合制備多肽鐵螯合鹽進(jìn)行過(guò)報(bào)道[3-4],本文以豬血多肽為原料,研究其與鐵鹽制備豬血多肽鐵螯合鹽的工藝條件,篩選出最佳的制備工藝參數(shù),以期為豬血多肽鐵螯合鹽的工業(yè)化制造提供有益借鑒和參考。

1 材料與方法

1.1 原輔料

豬血多肽粉,實(shí)驗(yàn)室自制。

氯化亞鐵、硫酸亞鐵、抗壞血酸、無(wú)水乙醇、鄰菲羅啉、鹽酸羥胺、氫氧化鈉、HCl,均為分析純?cè)噭?/p>

1.2 主要儀器與設(shè)備

752型紫外分光光度計(jì),上海精密科學(xué)儀器有限公司;SHZ-Ⅲ循環(huán)水真空泵,上海亞榮生化儀器廠;HH-S數(shù)顯恒溫水浴鍋,江蘇省金壇市富華儀器有限公司;DZF-6021型真空干燥箱,上海齊欣科學(xué)儀器有限公司;ESJ120-4型電子分析天平,沈陽(yáng)龍騰電子有限公司;PHS-3C+智能酸度計(jì),四川成都世紀(jì)方舟科技儀器有限公司離心機(jī)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 測(cè)試指標(biāo)

(1)鐵含量:鄰菲羅啉比色法[5]。

(2)鐵螯合率/%=(m1/m0)×100

式中:m1,螯合物中鐵的量(mg);m0,加入反應(yīng)體系中鐵的總量(mg)。

式中:m1,多肽鐵螯合鹽總量(mg);m0,反應(yīng)物總重量(mg)。

(4)水分:直接干燥法[6]。

(5)多肽:微量凱氏定氮法[7]。

(6)氯化鈉:容量法[8]。

1.3.2 豬血多肽鐵的螯合方法

(1)分別準(zhǔn)確稱(chēng)取3.0 g豬血多肽于5個(gè)錐形瓶中,將其配制成溶液濃度為30g/L,待多肽完全溶解后,加入1.0%的抗壞血酸,然后加入1.0 g氯化亞鐵(多肽與鐵的質(zhì)量比為3∶1),用質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%的NaOH或HCl溶液分別調(diào)pH值至3、4、5、6、7,充N(xiāo)2,于室溫下混合反應(yīng)10 min,冷卻后將反應(yīng)液在4000 r/min下離心20 min,上清液用無(wú)水乙醇處理得到沉淀,抽濾,收集濾渣,并反復(fù)洗滌抽濾2～3次,最后真空干燥得多肽螯合鐵,測(cè)定鐵含量。以上試驗(yàn)重復(fù)3次,取算術(shù)平均值。

(2)分別準(zhǔn)確稱(chēng)取豬血多肽1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 g于5個(gè)錐形瓶中,加蒸餾水溶解,使多肽溶液濃度為3.0%,待多肽完全溶解后,加入1.0%的抗壞血酸,然后分別加入1.0 g氯化亞鐵,使多肽與鐵的質(zhì)量比分別為1∶1,2∶1,3∶1,4∶1,5∶1,用質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%的 H Cl溶液調(diào) p H值為5,充 N2,于室溫下混合反應(yīng)10 min,冷卻后將反應(yīng)液在4000 r/min的轉(zhuǎn)速離心20 min,上清液用無(wú)水乙醇處理得到沉淀,抽濾,收集濾渣,并反復(fù)洗滌抽濾2～3次,最后真空干燥得多肽螯合鐵,測(cè)定鐵含量。以上試驗(yàn)重復(fù)3次,取平均值。

(3)分別準(zhǔn)確稱(chēng)取3.0 g豬血多肽于5個(gè)錐形瓶中,加蒸餾水溶解,使多肽溶液濃度分別為1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%,待多肽完全溶解后,加入1.0%的抗壞血酸,然后分別加入1.0 g亞鐵鹽(多肽與亞鐵鹽質(zhì)量比為3∶1),用質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%的 H Cl溶液調(diào) p H值為5,充 N2,于室溫下混合反應(yīng)10 min,冷卻后將反應(yīng)液在4000 r/min的轉(zhuǎn)速離心20 min,上清液用無(wú)水乙醇處理得到沉淀,抽濾,收集濾渣,并反復(fù)洗滌抽濾2～3次,最后真空干燥得多肽螯合鐵,測(cè)定鐵含量。以上試驗(yàn)重復(fù)3次,取平均值。

(4)分別準(zhǔn)確稱(chēng)取3.0 g豬血多肽于5個(gè)錐形瓶中,加蒸餾水溶解,使多肽溶液濃度為3.0%,待多肽完全溶解后,加入1.0%的抗壞血酸,然后分別加入1.0 g氯化亞鐵,用20%的 H Cl溶液調(diào) p H值為5,充N(xiāo)2,分別在15、25、35、45、55℃下混合反應(yīng)10 min,冷卻后將反應(yīng)液在4000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心20 min,上清液用無(wú)水乙醇處理得到沉淀,抽濾,收集濾渣,并反復(fù)洗滌抽濾2～3次,最后真空干燥得多肽螯合鐵,測(cè)定鐵含量。以上試驗(yàn)重復(fù)3次,取平均值。

(5)分別準(zhǔn)確稱(chēng)取3.0 g豬血多肽于5個(gè)錐形瓶中,加蒸餾水溶解,使多肽溶液濃度為3.0%,待多肽完全溶解后,加入1.0%的抗壞血酸,然后分別加入1.0 g氯化亞鐵,用20%的 H Cl溶液調(diào) p H值為5,充氮?dú)?于25℃下混合反應(yīng)10、20、30、40、50 min,冷卻后將反應(yīng)液在4000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心20 min,上清液用無(wú)水乙醇處理得到沉淀,抽濾,收集濾渣,并反復(fù)洗滌抽濾2～3次,最后真空干燥得多肽螯合鐵,測(cè)定鐵含量。以上試驗(yàn)重復(fù)3次,取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 亞鐵鹽種類(lèi)的選擇

多肽螯合鐵在乙醇等有機(jī)溶劑中的溶解度極小,如果選擇能夠溶解于有機(jī)溶劑中的亞鐵鹽作為鐵源與多肽進(jìn)行螯合反應(yīng),反應(yīng)完成后用有機(jī)溶劑進(jìn)行處理,剩余的游離鐵和多肽就能夠溶解于有機(jī)溶劑中,而生成的多肽螯合鐵則從有機(jī)溶劑中沉淀析出,這樣就可以使螯合鐵和游離鐵分離,從而得到純凈的多肽螯合鐵。室溫下,比較了硫酸亞鐵和氯化亞鐵在不同體積分?jǐn)?shù)乙醇溶液中的溶解情況,結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 兩種亞鐵鹽在乙醇溶液中的溶解情況

從表1中可看出,硫酸亞鐵在體積分?jǐn)?shù)40%～50%的乙醇溶液中只有部分溶解,在60%～100%的乙醇溶液中,硫酸亞鐵的溶解度幾乎完全不溶解。因此,若將硫酸亞鐵作為鐵源用于合成多肽螯合鐵,螯合反應(yīng)完成后不能使游離金屬離子和螯合物分離。由于氯化亞鐵能完全溶于不同濃度的乙醇溶液中,同時(shí)試驗(yàn)研究表明三氯化鐵也能溶于乙醇溶液中,因此可以用乙醇處理反應(yīng)液,游離的Fe2+或Fe3+溶解在乙醇中,而多肽螯合鐵在乙醇溶液中沉淀析出。因此,將氯化亞鐵作為鐵源,可以實(shí)現(xiàn)有機(jī)鐵和無(wú)機(jī)鐵的分離,進(jìn)而提高產(chǎn)品純度。

2.2 豬血多肽鐵螯合鹽的制備工藝研究

2.2.1 pH值對(duì)螯合反應(yīng)效果的影響

以鐵螯合率和多肽鐵螯合鹽得率為測(cè)試指標(biāo),研究pH值對(duì)螯合反應(yīng)效果的影響,結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 pH值對(duì)螯合反應(yīng)效果的影響

由圖1可知,隨著pH值的升高,鐵螯合率和多肽鐵螯合鹽得率均先增加后降低,當(dāng)pH值為5時(shí),二者均達(dá)到最大值。這是因?yàn)樵趐H較低的酸性條件下,H+將與金屬離子競(jìng)相爭(zhēng)奪供電子基團(tuán),從而不利于金屬螯合物的形成;隨著pH的升高,意味著溶液中OH-增加,游離鐵離子與OH-結(jié)合形成羥合Fe2+(氫氧化亞鐵)的機(jī)會(huì)增加,也不利于螯合鐵鹽的生成[9]。因此可初步確定螯合反應(yīng)的較適pH為5。

2.2.2 豬血多肽與亞鐵鹽質(zhì)量比對(duì)螯合反應(yīng)效果的影響

以鐵螯合率和多肽鐵螯合鹽得率為測(cè)試指標(biāo),研究豬血多肽與亞鐵鹽質(zhì)量比對(duì)螯合反應(yīng)效果的影響,結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 豬血多肽與亞鐵鹽質(zhì)量比對(duì)螯合反應(yīng)效果的影響

豬血多肽與亞鐵鹽的質(zhì)量比是影響螯合反應(yīng)的一個(gè)重要因素,質(zhì)量比太小,不能形成穩(wěn)定的環(huán)狀結(jié)構(gòu),螯合物不穩(wěn)定;質(zhì)量比太大,會(huì)造成多肽的浪費(fèi)[10]。從圖2可看出,隨著豬血多肽與亞鐵鹽質(zhì)量比的增加,鐵螯合率和多肽鐵螯合鹽得率均先增加后降低。因此可初步確定豬血多肽與亞鐵鹽的較適質(zhì)量比為3∶1。

2.2.3 豬血多肽溶液濃度對(duì)螯合反應(yīng)效果的影響

以鐵螯合率和多肽鐵螯合鹽得率為測(cè)試指標(biāo),研究多肽溶液濃度對(duì)螯合反應(yīng)效果的影響(見(jiàn)圖3)。

圖3 豬血多肽溶液濃度對(duì)螯合反應(yīng)效果的影響

由圖3可知,隨著豬血多肽溶液濃度的升高,鐵螯合率和多肽鐵螯合鹽得率均逐漸升高,但是當(dāng)多肽溶液濃度大于3.0%時(shí),鐵螯合率和多肽鐵螯合鹽得率有所降低,這可能是隨著多肽溶液濃度的升高,多肽溶液的溶解性降低,從而導(dǎo)致鐵螯合率和多肽鐵螯合鹽得率降低。因此,多肽溶液濃度以3.0%為宜。

2.2.4 溫度對(duì)螯合反應(yīng)效果的影響

以鐵螯合率和多肽鐵螯合鹽得率為測(cè)試指標(biāo),研究溫度對(duì)螯合反應(yīng)效果的影響,結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 溫度對(duì)螯合反應(yīng)效果的影響

從圖4可以看出,不同溫度條件下,鐵螯合率和多肽鐵螯合鹽得率基本相同,說(shuō)明反應(yīng)溫度對(duì)螯合反應(yīng)效果的影響不大,多肽與鐵的螯合反應(yīng)在室溫條件下就可以完成。此結(jié)果與文獻(xiàn)[11]的報(bào)道一致。因此,螯合反應(yīng)在25℃(室溫)條件下反應(yīng)即可。

2.2.5 時(shí)間對(duì)螯合反應(yīng)效果的影響

以鐵螯合率和多肽鐵螯合鹽得率為測(cè)試指標(biāo),研究時(shí)間對(duì)螯合反應(yīng)效果的影響,結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 時(shí)間對(duì)螯合反應(yīng)效果的影響

由圖5可知,不同的反應(yīng)時(shí)間,鐵螯合率和多肽鐵螯合鹽得率基本相同,說(shuō)明時(shí)間對(duì)螯合反應(yīng)效果的影響不大,多肽與鐵鹽的螯合反應(yīng)是一個(gè)快速反應(yīng)。此結(jié)果與文獻(xiàn)[12]的報(bào)道一致。因此,選取反應(yīng)時(shí)間為30 min。

2.2.6 豬血多肽鐵螯合鹽制備工藝條件的優(yōu)化

在上述單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,以pH值、多肽與亞鐵鹽質(zhì)量比和多肽溶液濃度為試驗(yàn)因素,以鐵螯合率為測(cè)試指標(biāo),擬通過(guò)L9(34)正交試驗(yàn)篩選出豬血多肽鐵螯合鹽制備的最佳工藝參數(shù),因素水平見(jiàn)表2,正交試驗(yàn)結(jié)果與極差分析見(jiàn)表3,方差分析見(jiàn)表4。

表2 因素水平表

由表3極差分析可知,對(duì)螯合反應(yīng)效果影響因數(shù)由主至次依次為pH值,多肽與亞鐵鹽質(zhì)量比,多肽溶液濃度,豬血多肽鐵螯合鹽制備的最佳工藝參數(shù)為pH值5,多肽與亞鐵鹽質(zhì)量比4∶1,多肽溶液濃度3.0%。從表4方差分析可看出,pH值對(duì)螯合反應(yīng)效果有極顯著影響,多肽與亞鐵鹽質(zhì)量比對(duì)螯合反應(yīng)效果有顯著影響,多肽溶液濃度對(duì)螯合反應(yīng)效果無(wú)顯著影響。

表3 L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果與極差分析表

表4 方差分析表

2.3 豬血多肽鐵螯合鹽的成分分析

對(duì)以上試驗(yàn)確定的最佳制備工藝條件下制得的豬血多肽鐵螯合鹽進(jìn)行成分分析,分析結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 豬血多肽鐵螯合鹽的成分

從表5可以看出,實(shí)驗(yàn)所制得的豬血多肽鐵螯合鹽中主要成分是多肽和鐵,但是其中還有較多的鈉鹽存在,這主要是由于調(diào)節(jié)pH值時(shí)加入的NaOH或HCl所致,在后續(xù)研究中可以通過(guò)透析、超濾等方法進(jìn)一步純化產(chǎn)品。

3 結(jié)論

(1)通過(guò)硫酸亞鐵和氯化亞鐵在不同體積分?jǐn)?shù)乙醇中溶解性的比較得知,氯化亞鐵更適合作為多肽與鐵進(jìn)行螯合反應(yīng)的鐵源。

(2)豬血多肽鐵螯合鹽的最佳制備工藝條件為:pH值5,多肽與亞鐵鹽質(zhì)量比4∶1,多肽溶液濃度3.0%。

(3)豬血多肽鐵螯合鹽的主要成分是多肽和鐵,其質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為70.02%和12.23%。

[1]Oscar Pineda H,DeWayne Ashmead.Effectiveness of treatment of iron-deficiency anemia in infants and young children with ferrous bis-glycinate chelate[J].Nutrition,2001,17(5):381-384.

[2]Fernando Pizarro,RaúlUicich,ManuelOlivares.et al.I-ron absorption of ferric glycinate is controlled by iron stores[J].Nutrition Research,1998,18(1):3-9.

[3]張亞麗,徐忠.脫脂豆粕多肽絡(luò)合亞鐵食品添加劑的制備及應(yīng)用研究[J].食品工業(yè)科技,2004,25(4):120-122.

[4]鄧尚貴,楊燊,秦小明.低值魚(yú)蛋白多肽—鐵(Ⅱ)螯合物的酶解制備及其抗氧化、抗菌活性[J].湛江海洋大學(xué)學(xué)報(bào),2006,26(4):54-58.

[5]黃偉坤.食品檢驗(yàn)與分析[M].北京:中國(guó)輕工業(yè)出版社,1981:225-226.

[6]食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn).GB 5009.3-2010.食品中水分的測(cè)定[S].

[7]食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn).GB 5009.5-2010.食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定[S].

[8]GB/T 12457-2008.食品中氯化鈉的測(cè)定[S].

[9]éric Ansoborlo,Badia Amekraz,Christophe Moulin,et al.Review of actinide decorporation with chelating agents[J].Comptes Rendus Chimie,2007(10/11):1010-1019.

[10]Ramon Burgada,Théodorine Bailly,Thierry Prangé,et al.Synthetic strategy of new powerful tris-bisphosphonic ligands for chelation of uranyl,iron,and cobalt cations[J].Tetrahedron Letters,2007,48(13):2315-2319.

[11]王麗霞,劉安軍,王穩(wěn)航.多肽-Fe抗貧血保健功能的研究[J].食品研究與開(kāi)發(fā),2006(27)7:179-181.

[12]徐志固.現(xiàn)代配位化學(xué)[M].化學(xué)工業(yè)出版社,北京:1987:175-183.

ABSTRACTThe chelating reaction condition was studied be tween pig blood polypeptide andmolysite.The ingredients of pig blood polypeptide-iron were also determined.The results showed that ferric chloride was suitable as iron source in chelatingwith pig blood polypeptide;the best condition was pH 5,the ratio of polypeptide and iron was 4∶1,solution concentration of polypeptide was 3.0%.The main contents of pig blood polypeptide-iron were polypeptide and iron with mass percents 70.02%and 12.23%,respectively.

Key wordspig blood polypeptide,iron,chelation,preparation

Study on Preparation of Pig Blood Polypeptide-iron

Wang Xue-rong1,Zheng Jiong2,Kan Jian-quan2
1(Animal Science Department of RongChang Campas of SouthwestUniversity Chongqing 402460,China)
2(Food Science Institute of SouthwestUniversity,Chongqing 400715,China)

博士,副教授(闞建全教授為通訊作者)。

＊現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專(zhuān)項(xiàng)資金資助;西南大學(xué)博士基金資助(09BSr07)

2009-12-18,改回日期:2010-04-13