翟振道 邢旭東 秦浩 季祥武

對(duì)氧磷酶(paraoxonase，PON)是由肝臟合成的一類與高密度脂蛋白(HDL)結(jié)合的芳香酯酶。PON合成后即與肝臟合成的apoA結(jié)合，參與HDL的形成并釋放入血。PON還能部分水解脂質(zhì)過氧化物，保護(hù)低密度脂蛋白(LDL)免受氧化修飾，減少氧化型脂質(zhì)積聚［1］。國內(nèi)外對(duì)Pon1Q192R基因多態(tài)性與冠心病的相關(guān)性研究結(jié)果不一，本研究通過對(duì)基因型分布及危險(xiǎn)因素(血糖、血脂、血壓)在不同基因型QQ、QR、RR之間的影響性進(jìn)行分析，給冠心病發(fā)病機(jī)制提供部分參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 調(diào)查對(duì)象 隨機(jī)選擇2004年4月至2005年12月在濰坊市人民醫(yī)院心內(nèi)科冠心病患者128例，男80例，女48例，年齡36～82歲，平均(65.25±9.83)歲，其中心肌梗塞69例，72例經(jīng)冠脈造影確診。病例符合2004年世界衛(wèi)生組織(WHO)關(guān)于缺血性心臟病的命名和診斷標(biāo)準(zhǔn)，冠心病組病例均有心梗病史或經(jīng)冠狀動(dòng)脈(冠脈)造影確診，冠脈造影時(shí)，各主要分支存在＞70%狹窄定義為有意義病變。隨機(jī)選擇同時(shí)期健康查體者110例，男66例，女44例，年齡31～87歲，平均(63.52±7.91)歲，作為對(duì)照組。對(duì)照組和冠心病組年齡、性別構(gòu)成差異無顯著性(P＞0.05)，經(jīng)詳細(xì)的詢問病史和體格檢查，心電圖、血常規(guī)、血生化檢查，簡化OGTT試驗(yàn)，排除冠心病、糖尿病、高血壓患者。所有調(diào)查個(gè)體間無血緣關(guān)系。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 血液基因組DNA的分離及PCR擴(kuò)增 按Erlich微量DNA全血提取法提取基因組DNA;抽取空腹12～14 h靜脈血0.5 ml(EDTA抗凝)，加0.5 ml裂解液，離心2 min(15000r/min)，棄上清。加裂解液0.75 ml，重復(fù)上述操作2次。加入A 緩沖液 0.5 ml，3 μl蛋白酶 K(1mg/ml)，55℃ 水浴 2 h，100℃煮10 min后，于-20℃保存?zhèn)溆?。PCR引物序列為上游5＇-TATTGTTGCTGTGGGACC-TGAG-3＇，下 游 5＇-CACGCTAAACCCAAATAC-ATCTC-3＇。PCR 反應(yīng)系統(tǒng)總體積為 30 μl，含 0.5μmol/L 引物，1.5 mmol/L MgCl2，200 μmol/L dNTP，0.2 ug DNA模板，2.0 UTaqDNA聚合酶，加礦物油復(fù)蓋后，95℃變性 5 min 后，94℃ 1 min，61℃ 1 min，72℃ 1 min，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)后，72℃保溫7 min結(jié)束反應(yīng)。以2%瓊脂糖凝膠電泳檢查PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

1.2.2 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的消化及電泳 取10 μl PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，加5U限制性內(nèi)切酶Alw(NewEngland Biolabs)，37℃消化3 h，取消化產(chǎn)物加入3%低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠板，在TBE緩沖液中電泳40 min。溴乙錠染色20 min，紫外光下拍照。

1.2.3 血脂血糖的檢測(cè) 晨起空腹12 h取靜脈2 ml血，應(yīng)用CX-9生化分析儀檢測(cè)血脂、血糖，血脂檢測(cè)包括TC、TG、HDL、LDL，單位mmol/l。正常對(duì)照組加做簡化OGTT試驗(yàn)。以上試劑盒均由北京利德曼生化技術(shù)有限公司提供。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 對(duì)所有數(shù)據(jù)采用SAS 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，其中計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)(或t’檢驗(yàn))，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 冠心病組與對(duì)照組的臨床資料情況見表1。

表1 冠心病組與對(duì)照組的臨床資料比較(x±s)

由表1可見:兩組男女比例，年齡無顯著性差異(P＞0.05)，舒張壓、BMI、膽固醇、LDL兩組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。冠心病組的收縮壓、三酰甘油、BS均明顯大于對(duì)照組，而HDL低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

2.2 病例組與對(duì)照組基因型分布及等位基因頻率比較見表2。

表2 病例組與對(duì)照組基因型分布及等位基因頻率

等位基因頻率［2］=(2×純合子數(shù)+雜合子數(shù))/2÷受檢人數(shù)

經(jīng)計(jì)算，正常對(duì)照組與冠心病組的基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡。冠心病組與對(duì)照組比較χ2=1.6686，自由度=2，P=0.4342，基因型分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，等位基因頻率也差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.3717)。

2.3 PON1基因型與冠心病經(jīng)典危險(xiǎn)因素的分布見表3。

表3 PON1基因型與冠心病經(jīng)典危險(xiǎn)因素的分布

由上表可見:冠心病患者不同的PON1基因型與傳統(tǒng)的冠心病危險(xiǎn)因素比較，除吸煙外差異均無顯著性(均P＞0.05)吸煙對(duì)含R基因的人群患冠心病具有更高的易感性。

2.4 限制性內(nèi)切酶Alw 消化PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果PCR產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶Alw消化后，當(dāng)該位點(diǎn)二等位基因均為純合子Q/Q時(shí)，PCR產(chǎn)物不被酶切，顯示99bp一條帶;當(dāng)該位點(diǎn)二等位基因均為純合子R/R時(shí)，PCR產(chǎn)物均被酶切，產(chǎn)生31bp和68bp兩條帶;當(dāng)該位點(diǎn)二等位基因?yàn)殡s合子Q/R時(shí)，則顯示31bp、68bp和99bp三條帶。結(jié)果見圖1。

圖1 PON1基因Q/R多態(tài)性分析電泳結(jié)果

由圖1可見:PON1基因有99bp(Q)和68 bp+31bp(R)兩個(gè)基因片斷，三種基因型:QQ、QR和RR型。

3 討論

PON1是由355個(gè)氨基酸組成，相對(duì)分子質(zhì)量為43～45×104的編碼蛋白［3］，含有3個(gè)半胱氨酸殘基，只有284位的殘基含有自由巰基組，是人類惟一與HDL結(jié)合的酶和血漿中惟一被發(fā)現(xiàn)的同工酶，因此，對(duì)它的研究比較廣泛。與其它的分泌蛋白比較，PON1的獨(dú)特特征是保留了N末端的疏水信號(hào)引導(dǎo)序列，能水解有機(jī)磷底物和對(duì)氧磷，個(gè)體間PON1抗對(duì)氧磷的酶活性相差10～40倍。

Sanghera等［4］研究認(rèn)為，結(jié)合在HDL-C上的PON蛋白能將脂質(zhì)過氧化物水解成乙醇和羧酸，PON與HDL-C上的另一種酶即血小板活性因子-乙酰水解酶(PAF-AH)協(xié)同作用，可使HDL發(fā)揮抑制LDL-C氧化修飾作用。LDL-C的氧化在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病中起重要作用，純化的人血清PON能減少LDL-C的氧化，降低體內(nèi)OX-LDL水平，降低脂質(zhì)過氧化物在血管壁的積累，從而起到了預(yù)防動(dòng)脈壁粥樣硬化的發(fā)生或減緩其進(jìn)程的作用，這可能是PON預(yù)防動(dòng)脈硬化形成的機(jī)制。

自從PCR技術(shù)應(yīng)用來，PON1192Q/R研究成果較多。對(duì)280例西班牙心肌梗死(MI)患者研究顯示MI患者的血清PON1活性較對(duì)照組明顯下降(216 U/L對(duì)比226 U/L)，PON1活性隨著年齡增加而下降［5］。有些研究未發(fā)現(xiàn)PON1基因多態(tài)性與冠心病有關(guān)。而是與PON1活性有關(guān)［6］。國外研究也有研究顯示PON1基因的Q192R多態(tài)性與CHD嚴(yán)重性、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展程度、血脂水平和降血脂藥物治療效果相關(guān)［7］。目前更多的研究PON1活性是冠心病的預(yù)測(cè)因素［8］。PON1活性及生物作用-抗氧化作用的水平?jīng)Q定了冠心病的程度［9］。

冠心病是多因素引起的疾病，在分析時(shí)只針對(duì)一個(gè)因素而在其他因素不均等的條件下分析，得出的結(jié)果是不可靠的。本研究設(shè)計(jì)是在正常對(duì)照組中測(cè)出各基因型，同時(shí)在隨機(jī)的冠心病(心肌梗塞或冠脈造影明顯狹窄＞70%)的病例組中測(cè)得各基因型和基因頻數(shù)的比例，通過統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，兩者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

本研究顯示，任何一種基因型都是在外界致病危險(xiǎn)因素的作用下起作用的，任何一種基因型在沒有肥胖、血壓、血糖、血脂異常情況下就不會(huì)導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化，在作用機(jī)制未明確的情況下，某些基因型最多只能說明是易患因素。PON1的作用是確定的，但它的生化作用機(jī)制不清，需進(jìn)一步明確。本研究結(jié)果與以往報(bào)道有所不同，可能是與以往認(rèn)為有關(guān)的結(jié)果是由于選擇研究對(duì)象的偏差和小樣本作用的結(jié)果［10］。這也顯示著，象糖尿病，家族性高脂血癥等在基因多態(tài)性并發(fā)CHD的高危方面起到了很大的作用。

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