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        飼料中蛋氨酸HPLC檢測方法的建立

        2010-09-03 10:39:30盧志勇高學軍黃建國劉曉飛李學琳
        飼料博覽 2010年10期
        關(guān)鍵詞:蛋氨酸緩沖液水解

        盧志勇,高學軍,黃建國,劉曉飛,李學琳

        (東北農(nóng)業(yè)大學乳品科學教育部重點實驗室,哈爾濱 150030)

        蛋氨酸是飼料中含硫氨基酸,在動物營養(yǎng)上有極大的價值。蛋氨酸的測定方法多種多樣,主要有離子交換色譜法、氨基酸分析法、紫外分光光度法、高效液相色譜(HPLC)檢測法等。但飼料在水解的過程中蛋氨酸會被部分氧化,離子交換色譜法、氨基酸分析法、紫外分光光度法無法準確測出蛋氨酸含量,而常規(guī)HPLC檢測法在測定時只注重測定水解物中的蛋氨酸,也無法準確計算出蛋氨酸的含量[1]。本試驗通過HPLC對蛋氨酸及蛋氨酸氧化物(蛋氨酸砜)進行柱前衍生,測定飼料中的蛋氨酸含量,從而提高對蛋氨酸檢測的準確度,為今后飼料蛋氨酸的檢測提供了一種準確可靠的方法。

        1 材料與方法

        1.1 儀器與試劑

        儀器:SPD-10AV高效液相色譜儀(日本島津生產(chǎn));N3000色譜工作站(浙江大學提供);微型漩渦混合儀(上海精科實業(yè)有限公司生產(chǎn));KQ-500DE型數(shù)控超聲清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司生產(chǎn));純水儀(PALL公司生產(chǎn))。

        試劑:DL-蛋氨酸標準品(色譜純,天津市光復精細化工研究所生產(chǎn));DL-蛋氨酸砜標準品(Alfa Aesar,Stock#B25094),其他試劑均為國產(chǎn)分析純;Na2CO3-NaHCO3緩沖液(pH 9.0);30 mg·mL-1CDNB 溶液(2,4-二硝基氯苯溶液)[2]。

        1.2 色譜條件

        C18不銹鋼分離柱 YMC(5 μm 4.6×150 mm);流動相:含φ=30%乙腈的0.01 mol·L-1NaAC緩沖液(pH 5.2),取 0.01 mol·L-1pH 5.2 NaAC 緩沖液700 mL與色譜純乙腈300 mL混合,經(jīng)0.45 mm微孔濾膜真空抽濾,超聲脫氣;檢測波長350 nm;柱溫 25℃;流速 0.8 mL·min-1。衍生后的試劑經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后直接上樣,體積10 μL,測定其中蛋氨酸含量。

        1.3 樣品液的準備

        稱取含蛋白質(zhì)10~20 mg的試樣(約50~100 mg,準確至 0.1 mg),按照 GB/T 18246-2000中酸水解法進行水解。水解后冷卻,混勻,用40%的NaOH調(diào)pH到7.0,過濾,用三蒸水反復沖洗離心管和濾器,定容至50 mL,吸取1 mL濾液,待用。

        1.4 蛋氨酸、蛋氨酸砜和氨基酸水解液的衍生

        配置含蛋氨酸 2、5、10、20、40、60、80 μg·mL-1的蛋氨酸標準液各 1 mL[3]。分別置于 6個20 mL的離心管中,再分別加入pH 9.0 Na2CO3-NaHCO3緩沖液2 mL,混勻后,加入過量的CDNB(1:1.39),用微型漩渦混合儀混勻,置于 80℃ 恒溫水浴鍋中,避光暗反應 1 h,取出,冷卻至室溫,用 0.05 mol·L-1鹽酸調(diào) pH至 7.0,用三蒸水稀釋至50 mL容量瓶中定容,混勻。蛋氨酸砜和氨基酸水解液處理步驟同上。

        1.5 蛋氨酸含量計算

        蛋氨酸的分子式為C5H11O2NS,蛋氨酸砜的分子式為C5H11NO4S,在試樣水解過程中,蛋氨酸會部分氧化成蛋氨酸砜,由化學性質(zhì)可以得出1 mol蛋氨酸氧化生產(chǎn)1 mol蛋氨酸砜,通過物質(zhì)量的比可準確算出蛋氨酸的總量,見式(1)。

        其中,m1為蛋氨酸砜的質(zhì)量;m2為蛋氨酸的質(zhì)量。

        1.6 飼料蛋氨酸含量的測定

        按一定比例將豆粕和玉米蛋白粉進行復配,通過益生菌發(fā)酵獲得富含蛋氨酸飼料,稱取50 mg,按照GB/T 18246-2000中酸水解法進行水解。

        2 試驗結(jié)果

        2.1 蛋氨酸標準樣品衍生后峰形的鑒別和標準曲線的建立

        蛋氨酸標準品衍生液HPLC結(jié)果見圖1,標準曲線見圖2。

        由圖1可見,從左邊起第 1個峰為CDNB在堿性條件下形成的DNP-OH,第2個峰為經(jīng)CDNB衍生生成的DNP-蛋氨酸,為目的峰,出峰時間為9.788 min。以峰面積(μV.s)對進樣濃度(μg·mL-1)所得作直線回歸,獲得回歸方程Y=6169.9X-40468。在進樣量為2~80 μg·mL-1的范圍內(nèi),經(jīng)重復進樣,線性系數(shù)均在0.9839,在此范圍內(nèi)進樣濃度峰面積呈良好的線性相關(guān)。

        圖1 60 μg·mL-1的標準品衍生液 HPLC 結(jié)果

        圖2 蛋氨酸標準曲線

        2.2 蛋氨酸砜標準樣品衍生后峰形的鑒別和標準曲線的建立

        蛋氨酸砜標準品衍生液HPLC結(jié)果見圖3,標準曲線見圖4。

        圖3中從左邊起第 1個峰為 CDNB在堿性條件下形成的DNP-OH,第2個峰為經(jīng)CDNB衍生生成的DNP-蛋氨酸砜,為目的峰,出峰時間為8.463 min。獲得回歸方程 Y=2912.2X-10844,R2=0.9919。

        2.3 飼料樣品衍生圖譜分析

        飼料樣品衍生液HPLC結(jié)果見圖5。

        由圖5可知,8.472 min為蛋氨酸砜的目的峰,9.797 min為蛋氨酸的目的峰。結(jié)果表明,蛋氨酸和蛋氨酸砜衍生后目的峰分離良好,把峰面積代入標準曲線中,經(jīng)計算可以準確的得出飼料中蛋氨酸總量。本試驗選取飼料樣品檢測結(jié)果為每克飼料中含有蛋氨酸163.56 mg。

        3 討論

        本試驗對蛋氨酸和蛋氨酸氧化物(蛋氨酸砜)進行柱前衍生,并采用HPLC方法準確地測定了飼料氨基酸水解液中的蛋氨酸總量。目前有兩種新型衍生劑6-氨基喹啉基-N-羥基-琥珀酰亞胺基甲酸酯(AOC)和 2,4-二硝基氯苯(CDNB)[4]。本試驗選取新型衍生劑CDNB,不但價格便宜,易購得,而且能與蛋氨酸和蛋氨酸氧化物生成性質(zhì)穩(wěn)定的二硝基氯苯蛋氨酸和二硝基氯苯蛋氨酸砜,而過量的CDNB對試驗無影響,線性關(guān)系良好。衍生后經(jīng)HPLC C18柱分離,UV 350 nm檢測,用含有φ=30%乙腈的 0.01 mol·L-1NaAC 緩沖液(pH 5.2)為流動相,蛋氨酸和蛋氨酸砜與其他氨基酸分離良好。本試驗研究了飼料中蛋氨酸含量的測定方法,較好地解決了蛋氨酸在酸性水解過程中易氧化難以測定的問題,提高了蛋氨酸測定的準確度,為測定飼料中蛋氨酸含量提供了新的方法。

        [1]常碧影,閻惠文,張明,等.飼料氨基酸的測定國標研制[J].飼料工業(yè),2000,21(2):1-4.

        [2]趙劍虹.柱前紫外衍生——高效液相色譜法測定血清和飲料中18種游離氨基酸[D].成都:四川大學,2006.

        [3]黃建國,高學軍,佟慧麗,等.HPLC測定飼料源小肽產(chǎn)品中賴氨酸含量[J].乳業(yè)科學與技術(shù),2009(2):78-80.

        [4]Callejón R M,Tesfaye W,Torija M J,et al.HPLC determination of amino acids with AQC derivatization in vinegars along submerged and surface acetiWcations and its relation to the microbiota[J].Eur Food Res Technol,2007,227:93-102.

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