張念志 許祥穩(wěn) 李國(guó)琳 陳 煒 師董芳 劉光明

1 安徽中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院（合肥 230031）

2 安徽中醫(yī)學(xué)院碩士生（合肥 230031）

參七蟲草膠囊對(duì)肺纖?維化大鼠TGF-β1mRNA表達(dá)的影響*

張念志1許祥穩(wěn)2李國(guó)琳1陳 煒1師董芳2劉光明2

目的探討參七蟲草膠囊對(duì)肺纖維化大鼠TGF-β1mRNA表達(dá)的影響。方法采用博萊霉素致肺纖維化大鼠模型，大鼠處死后分離大鼠肺組織，應(yīng)用RT-PCR半定量及圖像分析方法，對(duì)空白組、模型組、參七蟲草膠囊高劑量組、中劑量組、低劑量組及潑尼松組大鼠肺組織TGF-β1mRNA表達(dá)水平進(jìn)行觀察。結(jié)果參七蟲草膠囊高劑量組、中劑量組、低劑量組及潑尼松組大鼠肺組織TGF-β1mRNA表達(dá)水平明顯低于模型組。結(jié)論參七蟲草膠囊高、中、低劑量及潑尼松均可調(diào)控博萊霉素致肺纖維化大鼠TGF-β1mRNA表達(dá)水平，從而減輕肺纖維化的程度。

參七蟲草膠囊 肺纖維化 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)

1 安徽中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院（合肥 230031）

2 安徽中醫(yī)學(xué)院碩士生（合肥 230031）

*安徽省教育廳自然科學(xué)研究項(xiàng)目（No.2004kj262）

肺纖維化是以細(xì)胞外基質(zhì) （ECG）的沉積為主要特征的疾病，其起病隱襲，主要癥狀為進(jìn)行性呼吸困難，常有干咳、少痰，咳嗽可呈陣發(fā)性，止咳藥效果不佳。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）最初是從血小板中分離出來(lái)的一種細(xì)胞因子,因其能促進(jìn)成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)而得名;TGF-β主要來(lái)源于巨噬細(xì)胞、上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞,是一組多功能的調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和分化的細(xì)胞因子。肺臟是富含TGF-β的器官之一,肺纖維化直接與TGF-β的過(guò)度表達(dá)，ECG的過(guò)度積累有關(guān)。體外實(shí)驗(yàn)Western印記分析表明,BLM鼠肺纖維母細(xì)胞用TGF-β1抗體孵化后,以劑量依賴的方式抑制博萊霉素誘導(dǎo)的TG-β1大量釋放和蛋白多糖的表達(dá)[1]。本實(shí)驗(yàn)從分子生物水平出發(fā)，應(yīng)用RT-PCR方法分析參七蟲草膠囊對(duì)博萊霉素致肺纖維化大鼠肺組織TGF-β1mRNA表達(dá)的影響[2]，從基因水平探討TGF-β1在肺纖維化中的作用?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 （1）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：取健康Wistar大鼠60只，雌雄各半，清潔級(jí)，購(gòu)于南京醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心[生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（蘇）2002-0031]。（2）治療藥物：醋酸潑尼松片[上海醫(yī)藥（集團(tuán)）有限公司信誼制藥總廠產(chǎn)品]，參七蟲草膠囊 （每粒0.4g）由西洋參、參三七、冬蟲夏草3味藥物按照1∶1∶1比例制成膠囊（安徽中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院制劑中心提供）。實(shí)驗(yàn)時(shí)用蒸餾水將參七蟲草膠囊配成所需濃度的混懸液[3]。（3）注射用鹽酸博萊霉素 （日本化藥株式會(huì)社），DEPC（Amresco），TRIZOL（Invitrogen），異丙醇、三氯甲烷、無(wú)水乙醇（國(guó)藥集團(tuán)），RT-PCR試劑盒（Promega，100T），Taq 酶（Promega），dNTP（Promega），DNA Marker（DL2000）（TaKaRa），瓊脂糖（西班牙），冰乙酸、溴化乙錠（EB，Amresco）。（4）儀器：臺(tái)式冷凍高速離心機(jī)、臺(tái)式高速離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf），UV-754紫外分光光度計(jì)（上海第三分析儀器廠），F(xiàn)A1104型電子天平（上海衡平儀器廠），電泳儀（美國(guó)BIO-RAD公司），水平電泳槽（美國(guó)BIO-RAD公司），精密數(shù)顯酸度計(jì) （上海天達(dá)儀器有限公司），三洋-80℃低溫冰柜（SANYO公司），超凈工作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司），ATC 201型PCR擴(kuò)增儀（美國(guó)APPOLO公司），溫度梯度基因擴(kuò)增儀（德國(guó)MIONETRA），托盤天平（上海第二天平儀器廠），凝膠成像系統(tǒng)（江蘇省捷達(dá)科技發(fā)展有限公司），漩渦混勻器（太倉(cāng)市科教器材廠），UPK-I-10純水機(jī)（成都超純科技有限公司），數(shù)顯三用水浴箱（江蘇省金壇榮華儀器制造有限公司）。（5）引物：引物設(shè)計(jì)根據(jù)Genbank,采用Prime5軟件設(shè)計(jì)，由上海生物工程公司合成。TGF-β1（332bp）上游為 5′-TAATGGTGGACCGCAACAAC-3′，下游為 5′-GTGAGCACTGAAGCGAAAGC-3′;β -actin（513bp）上游為 5′-TGTGATGGTGGGTATGGGTAC-3′，下游為 5′-TTAATGTCACGCACGATTTCC-3′。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 取Wistar大鼠60只，雌雄各半，隨機(jī)分為空白對(duì)照組、肺纖維化模型組、參七蟲草膠囊高劑量組、參七蟲草膠囊中劑量組、參七蟲草膠囊低劑量組、醋酸潑尼松組，每組10只。各組大鼠自由攝食飲水，除空白對(duì)照組大鼠不加處理外，其余5組大鼠均采用博萊霉素氣管內(nèi)滴注造模，應(yīng)用3.6%水合氯醛（1mL/100g體重）麻醉大鼠，切開(kāi)氣管，應(yīng)用博萊霉素（0.5mg/100g體重）氣管內(nèi)滴注。造模后24h參七蟲草膠囊低劑量組予以參七蟲草膠囊0.025g·100g-1·d-1灌胃，參七蟲草膠囊中劑量組予以參七蟲草膠囊0.035g·100g-1·d-1灌胃，參七蟲草膠囊高劑量組予以參七蟲草膠囊0.07g·100g-1·d-1灌胃[4]，潑尼松組予以0.6mg·100g-1·d-1灌胃，模型組及空白組繼續(xù)自由攝食飲水。造模成功后1個(gè)月處死動(dòng)物，采取肺組織標(biāo)本，儲(chǔ)存于-80℃冰箱。

1.3 肺組織TGF-β1mRNA表達(dá)測(cè)定 取50～100mg肺組織于勻漿器中制備肺組織勻漿。（1）從肺組織細(xì)胞中提取總RNA。（2）cDNA第1鏈的合成：70℃孵育5μl總RNA 10min，輕輕搖蕩后迅速置于冰上;然后準(zhǔn)備AMV逆轉(zhuǎn)錄酶0.6μL，Olig（dT）1μL，25mmol MgCl24μL,10×Buffer 2μL,10mmol dNTP 2μL,RNA酶抑制劑 0.5μL，總RNA 5μL,DEPC-H2O加至20L混勻。42℃孵育60min;95℃加熱5min，然后冰浴5min，于-20℃保存。（3）TGF-β1片段及β-actin的擴(kuò)增：準(zhǔn)備模板cDNA 1μL，上游引物 （10μmol/L）1μL，下游引物 （10μmol/L）1μL，10×PCR buffer 2.5μL， dNTP（2.0mmol/L） 2.5μL，Taq 酶（5.0U/μL）0.2μL，ddH2O 16.8μL，總體積 25μL,94℃預(yù)變性5min，94℃變性 40s，50℃ （β -actin 51℃） 退火 40s，72℃延伸40s，共35個(gè)循環(huán);72℃延伸10min，4℃保存。（4）1%瓊脂糖凝膠行PCR產(chǎn)物的電泳分析：取出凝膠，在紫外觀察燈下觀察結(jié)果并拍片。拍照后應(yīng)用捷達(dá)凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行面積灰度掃描,以條帶光密度值代表其表達(dá)量,計(jì)算出目的基因的相對(duì)表達(dá)量，然后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，采用單因素方差分析及LSD法。

2 結(jié)果

結(jié)果見(jiàn)圖1、表1。模型組TGF-β1mRNA表達(dá)水平明顯高于空白組 （P＜0.01）;參七蟲草膠囊高劑量組TGF-β1mRNA表達(dá)水平明顯低于參七蟲草膠囊中劑量組和參七蟲草膠囊低劑量組 （P＜0.01）;參七草膠囊中劑量組TGF-β1mRNA表達(dá)水平表達(dá)水平低于參七蟲草膠囊低劑量組（P＜0.05）;參七蟲草膠囊高、中劑量組和潑尼松組TGF-β1mRNA表達(dá)水平明顯低于模型組 （P＜0.01）;參七蟲草膠囊低劑量組TGF-β1mRNA表達(dá)水平低于模型組（P＜0.05）;潑尼松組TGF-β1mRNA表達(dá)水平明顯低于參七蟲草膠囊中、低劑量組（P＜0.01）。

圖1 各組肺組織TGF-β1mRNA表達(dá)

表1 各組肺組織TGF-β1mRNA表達(dá)比較 （±s）

表1 各組肺組織TGF-β1mRNA表達(dá)比較 （±s）

與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01;與參七蟲草高劑量組比較，△P＜0.01;與參七蟲草中劑量組比較，▲P＜0.05;與潑尼松組比較，●P＜0.01

n組 別空白組模型組參七蟲草膠囊高劑量組參七蟲草膠囊中劑量組參七蟲草膠囊低劑量組潑尼松組10 10 10 10 10 10 TGF-β1mRNA 139.04±9.95**193.96±6.61 160.19±9.20**178.34±5.17**△●185.88±7.79*△▲●155.19±8.78**

3 討論

肺纖維化是由于過(guò)多的成纖維細(xì)胞（Fb）聚集和大量細(xì)胞外的基質(zhì)成分沉積并伴炎癥和損傷而導(dǎo)致正常的肺組織結(jié)構(gòu)改變和功能喪失的一類疾病。多種因素均可引起肺纖維化,如職業(yè)性粉塵暴露（SiO2等）、放射性損傷、感染后、結(jié)節(jié)病等自身免疫性疾病、肺移植后、某些藥物及原因不明的肺纖維化、特發(fā)性肺纖維化（IPF）等。目前,肺纖維化發(fā)生的確切機(jī)制還不十分清楚,尚未找到突破性的防治手段。TGF-β1在肺纖維化及其他纖維增殖性疾病中發(fā)揮了重要作用,被大多數(shù)學(xué)者公認(rèn)為肺纖維化形成與發(fā)展的關(guān)鍵性細(xì)胞因子。研究發(fā)現(xiàn)TGF-β1基因具有多態(tài)性,而且這種多態(tài)性能影響其轉(zhuǎn)錄,并與多種因素引起的PF中TGF-β1水平特征性升高密切相關(guān)。TGF-β1主要作用于膠原的轉(zhuǎn)錄和翻譯過(guò)程,能誘導(dǎo)前膠原mRNA產(chǎn)生,從而促進(jìn)膠原蛋白的形成沉積。在肺的發(fā)育過(guò)程中,TGF-β1各亞型和TGF-β1mRNA主要分布于細(xì)支氣管、支氣管黏膜上皮、支氣管腺體、支氣管和脈管平滑肌和肺泡巨噬細(xì)胞中[5]。TGF-β1不僅能刺激成纖維細(xì)胞增殖及分泌膠原,還能抑制膠原的降解,在肺纖維化發(fā)展中起關(guān)鍵作用[6]。中醫(yī)學(xué)多將肺纖維化歸屬于 “肺痹”、“肺痿”范疇，根據(jù)中醫(yī)學(xué)理論，結(jié)合中醫(yī)證候臨床流行病學(xué)調(diào)查資料和本研究團(tuán)體的長(zhǎng)期臨床實(shí)踐，我們認(rèn)為肺纖維化早期為肺虛，繼而導(dǎo)致脾腎虧虛。但虛久必瘀，瘀致氣阻，虛瘀氣阻互結(jié)是肺纖維化發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié);即虛瘀貫穿于肺纖維化的全過(guò)程。本研究以益氣養(yǎng)陰、活血化瘀、益肺固腎法則，采用參七蟲草膠囊[7]，方中西洋參為君藥，輔以冬蟲夏草益肺腎之精，佐以參三七活血化瘀歸肝胃經(jīng)以治標(biāo)。諸藥合用，標(biāo)本同治，補(bǔ)虛不留邪，祛邪不傷正，在臨床應(yīng)用過(guò)程中效果明顯。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)參七蟲草膠囊高劑量組、中劑量組、低劑量組和潑尼松組均具有降低TGF-β1mRNA表達(dá)水平的作用，且參七蟲草膠囊高、中劑量組降低TGF-β1mRNA表達(dá)水平優(yōu)于參七蟲草膠囊低劑量組。潑尼松組和參七蟲草膠囊高劑量組相比對(duì)降低TGF-β1mRNA表達(dá)水平的作用無(wú)顯著差異，而潑尼松組降低TGF-β1mRNA表達(dá)水平顯著優(yōu)于參七蟲草膠囊中、低劑量組。本實(shí)驗(yàn)從基因水平觀察了參七蟲草膠囊對(duì)肺纖維化大鼠TGF-β1mRNA表達(dá)水平的作用，為參七蟲草膠囊防治肺纖維化提供了理論基礎(chǔ)，同時(shí)也為參七蟲草膠囊結(jié)合潑尼松治療肺纖維化從而減輕糖皮質(zhì)激素的副作用提供了可行性依據(jù)。

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Effects of Shenqichongcao Capsule on the Expression of TGF-β1mRNA of Pulmonary Fibrosis Rats

ZHANG Nian-zhi1,XU Xiang-wen2,LI Guo-lin1,et al
1 The First Affiliated Hospital of Anhui University of Traditional Chinese Medicine（Hefei 230031）2 Anhui University of Traditional Chinese Medicine（Hefei 230031）

Objective:To evaluate the Shenqichongcao Capsule on the expression of TGF-β1mRNA of pulmonary fibrosis rats.Methods:Rats,induced lung fibrosis by bleomycin,were isolated lung tissues and used RT-PCR and semi-quantitative image analysis method to analysis expression levels of TGF-β1mRNA of the normal control group,the model group,the Shenqichongcao Capsule high dose group,the medium dose group,the low dose group and the prednisone group.Results:The expression levels of TGF-β1mRNA in the lung tissue of the Shenqichongcao Capsule high dose group,the medium dose group,the low dose group and the prednisone group were significantly lower than that of the model group.Conclusion:The expression levels of TGF-β1mRNA in the lung tissues could be regulated in the Shenqichongcao Capsule high dose group,the medium dose group,the low dose group and the prednisone group.And then,the degree of lung fibrosis in rats of these groups could be reduced.

Shenqichongcao Capsule;Lung fibrosis;TGF-β1;RT-PCR

R285.5

A

1004-745X（2010）01-0089-03

2009-08-06）