王秀梅,陳世義*,于海濱,劉玉潔

(1.吉林大學(xué)第一醫(yī)院 皮膚科,吉林 長春 130021;2.北京佑安醫(yī)院皮膚科,北京 100054)

普通PCR與巢式PCR檢測生殖器皰疹病毒的對照

王秀梅1,陳世義1*,于海濱2,劉玉潔1

(1.吉林大學(xué)第一醫(yī)院 皮膚科,吉林 長春 130021;2.北京佑安醫(yī)院皮膚科,北京 100054)

*通訊作者

生殖器皰疹(GH)是由單純皰疹病毒(HSV)引起性傳播疾病(STD),GH典型表現(xiàn)臨床上診斷并不困難,但對于不典型表現(xiàn)容易漏診或誤診。HSV主要通過生殖器或肛門、呼吸道、口腔粘膜的分泌物傳播。以往病毒培養(yǎng)被看做GH診斷的金標(biāo)準(zhǔn),但需要約2周的時(shí)間,相比之下,普通PCR用不到2小時(shí)的時(shí)間,敏感性和特異性高于病毒培養(yǎng),且檢測HSV的同時(shí),對其進(jìn)行分型。近來巢式PCR以其較高的靈敏度與特異性在臨床檢驗(yàn)中逐漸開展.普通PCR與巢式PCR分別檢測HSV二者關(guān)系如何,現(xiàn)就此作初步的探討。

1 材料和方法

1.1 臨床資料 標(biāo)本為我科性病門診就診、按衛(wèi)生部標(biāo)準(zhǔn)診斷為GH的254名病人,男142人,女102人,年齡18-62歲,平均28.6歲。復(fù)發(fā)頻率3次/月-1次/6月,病程 1天-6年.＜5天者128例,5-10天者64例,＞10天者62例。皮損形態(tài):水皰90例,糜爛108例,結(jié)痂56例。

1.2 主要儀器與試劑 美國MGResearch PCR擴(kuò)增儀PTC-100,德國Heraeus高速臺式離心機(jī),中國FX-302暗箱式紫外檢測分析儀,美國PROMEGA公司產(chǎn)瓊脂糖、Taq 酶、DNTP。

1.3 取材 用生理鹽水清潔水皰處皮膚,用棉拭子取水皰處皰液;皮疹為糜爛、潰瘍或結(jié)痂者,先用鈍刀去除表面的分泌物、痂皮、痂屑,輕刮(以不出血為度)糜爛、潰瘍基底部,再用棉拭子輕擦皮損表面(尤其邊緣部位),置-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 處理方法

1.4.1 處理PCR標(biāo)本 將冷凍融化或新采集后的標(biāo)本置于1 ml生理鹽水Eppendorf管中,貼壁擠出拭子中的水分,棄拭子,15 000 rpm 4℃離心 10 min,棄上清,將 50 μ l蛋白酶 K 裂解液(含 0.5%NP-40、0.5%TWEEN20、蛋白酶K 1 μ g/μ l)加入至沉淀中,充分振蕩混均后56℃水浴2 h,煮沸10 min,15 000 rmp離心10 min,取5 μ l上清液作為反應(yīng)模板。

1.4.2 巢式PCR和普通PCR反應(yīng) (1)參照S.Jain設(shè)計(jì)根據(jù)已知的HSV-1 gpD基因序列合成兩對引物:HSV-1A甲5'-ATCACGGTAGCCCGGCCGTGTGTGACA-3'HSV-1 gpD 19-43 nt;HSV-1 A乙5'-CATACCGGAACGCACCACACAA-3'HSV-1 gpD 218-239 nt;HSV-1 A丙5'-CCATACCGACCACACCGACGA-3'HSV-1 gpD 51-71 nt;HSV-1A丁5'-GGTAGTTGGTCGTTCGCGCTGAA-3'HSV-1 gpD 166-188 nt。

引物A甲、A乙擴(kuò)增片段為221 pb;引物A丙、A丁擴(kuò)增片段為138 bp。

(2)參照S.P.V.Cogle設(shè)計(jì)據(jù)已知的HSV-2gpG基因序列合成兩對檢測HSV-2引物:HSV-2 B甲 5'TCAGCCCATCCTCCTTCGGCAGTA-3'HSV-2 gpG 363-386 nt,HSV-2 B乙5'-GATCTGGTACTCGAATGTCTCCG-3'HSV-2 gpG 524-546 nt;HSV-2 B丙5'-AGACGTGCGGGTCGTACACG-3'HSV-2 gpG 422-441 nt;HSV-2 B丁5'-CGCGCGGTCCCAGATCGGCA-3'HSV-2 gpG 503-522 nt。

引物B甲和B乙的擴(kuò)增片段為184bp,引物B丙和B丁的擴(kuò)增片段為101 bp。

(3)普通PCR與巢氏PCR反應(yīng)系統(tǒng):總反應(yīng)液體量 25 μ l,其中 10×PCR 緩沖液(10 mmol/L Tris-HCl,50 mmol/L KCl)2.5 μ l,dNTp 、引物 5pmol各 0.2 mM,3.5 mM MgCl2,待檢測樣品 5 μ l,TaqDNA 聚合酶(1 U/1 μ l)1 μ l,其余用雙蒸水補(bǔ)足,混勻后加入50 μ l液體石臘,設(shè)加標(biāo)準(zhǔn)樣模板的陽性對照和不加模板的陰性對照。第一次PCR反應(yīng)用引物A甲,A乙,B甲,B乙;93℃30 s,55℃60 s,72℃60 s,循環(huán) 35次,最后一個(gè)循環(huán)于72℃充分延伸5分鐘。第二次PCR反應(yīng)引用產(chǎn)物為A丙,A丁,B丙,B丁,取0.5 μ l模板為第一次PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物,于93℃預(yù)變性2 min,93℃30 s,55℃60 s,72℃60 s,30個(gè)循環(huán)后72℃充分延伸5 min,常規(guī)PCR同第一次反應(yīng)。

(4)判定結(jié)果:取10 μ l PCR反應(yīng)產(chǎn)物,2%瓊脂糖漿上電泳(含10 μ g/ml溴化乙錠),紫外線分析儀觀察反應(yīng)結(jié)果,第一次PCR反應(yīng)HSV-1、HSV-2分別出現(xiàn)221 bp、184 bp,第二次反應(yīng)HSV-1、HSV-2分別出現(xiàn) 138 bp、101 bp。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用 χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 254名檢測的患者中,普通 PCR檢測220(86.61%)例陽性,而巢式PCR檢測242(95.28%)例陽性。和普通PCR相比,巢式PCR可以檢測出普通PCR陰性的22(8.66%)例患者。在巢式PCR檢測陽性的242名患者中61(25.2%)名為HSV-1感染,181(74.8%)名為HSV-2感染,普通PCR所對應(yīng)的結(jié)果分別為54(24.5%)、166(75.5%)。(見表1)

表1 兩種方法檢測HSV及分型

2.2 242名HSV陽性的患者中,161(66.5%)名為初次感染,其中 53(32.9%)名由HSV-1引起,108(67.1%)名由HSV-2感染引起;81(33.5%)名為復(fù)發(fā)型生殖器皰疹,其中8(9.9%)名為HSV-1引起,73(90.1%)為HSV-2感染引起。(見表2)

表2 巢式PCR檢測原發(fā)型與復(fù)發(fā)型生殖器皰疹HSV比較

3 討論

在254名患者中,巢式PCR檢測 242名患者HSV陽性,而普通PCR檢測出220名,由此可以看出巢式PCR的敏感性更高。兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。沒有一例患者普通PCR陽性巢式PCR陰性,顯示出巢式PCR的特異性為100%。巢式PCR可以檢測出普通PCR為陰性的64.7%HSV感染的患者。

在普通PCR陽性的220名患者中,54(24.5%)由HSV-1引起,166(75.5%)由HSV-2引起;巢式PCR陽性的242名患者中,61(25.2%)名由SHV-1引起,181名(74.8%)由HSV-2感染引起。在此項(xiàng)研究中這兩種檢測手段的分型相似,四分之三的生殖器皰疹由HSV-2感染引起。四分之一的生殖器皰疹由HSV-1感染引起,這與國際報(bào)道的有所差異[1],可能與地域因素或選擇的病例不同有關(guān)。在一項(xiàng)研究中表明由HSV-1引起的GH在大學(xué)年輕人中已增長至78%[2]。雖然由HSV-1引起的GH癥狀較嚴(yán)重,但復(fù)發(fā)的頻率、無癥狀排毒次數(shù)比HSV-2引起者少,且確診 1年后很少復(fù)發(fā)[3],臨床上容易控制;HSV-2引起者,由于頻繁復(fù)發(fā),導(dǎo)致情緒變化,加重心理負(fù)擔(dān)。HSV-1引起的GH可能防止HSV-2的感染[4],而只感染HSV-2的人比同時(shí)感染HSV-1、HSV-2的人發(fā)生生殖器潰瘍的可能性大[3],由此推斷感染HSV-2的人感染、傳播性病的可能性更大。

巢式PCR對原發(fā)性和復(fù)發(fā)性GH檢測及分型的結(jié)果支持由HSV-1引起的生殖器皰疹比HSV-2引起的有更低的復(fù)發(fā)率,預(yù)后較好。臨床上支持GH診斷的12(4.72%)名患者巢式PCR檢測為陰性。12名患者中,1名患者發(fā)現(xiàn)有原發(fā)性梅毒的感染,2名患者有外傷引起的生殖器潰瘍的病史。

這項(xiàng)研究表明,巢式PCR以更高的靈敏度與特異性更適于HSV的檢測。對單純皰疹病毒檢測的同時(shí)對其進(jìn)行分型對GH的防治有重要意義。

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1007-4287(2010)01-0118-02

王秀梅(1983-),女,碩士研究生,主要研究方向?yàn)槠つw病與性病診治。

2009-06-15)