樂文靜 蘇曉紅 李賽 劉玉榮 張津萍 朱小鳳 王寶璽

巢式聚合酶鏈反應(yīng)檢測男性尿道炎患者尿液中陰道毛滴蟲

樂文靜 蘇曉紅 李賽 劉玉榮 張津萍 朱小鳳 王寶璽

目的建立兩種巢式聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)方法檢測男性尿道炎患者尿液中陰道毛滴蟲感染狀況,評價兩種巢式PCR在臨床診斷中的應(yīng)用價值。方法2011年4月至2013年12月來我院性病門診就診的1 088例男性尿道炎患者為研究對象,收集尿道拭子標(biāo)本做分泌物涂片鏡檢、陰道毛滴蟲濕片檢測以及淋球菌培養(yǎng),同時收集尿液標(biāo)本提取DNA,針對陰道毛滴蟲重復(fù)基因組和β微管蛋白基因,采用兩種巢式PCR法檢測尿液中陰道毛滴蟲。結(jié)果濕片法檢測陰道毛滴蟲的陽性率為0,而兩種巢式PCR法均檢測出29例陽性標(biāo)本,陽性率為2.67%,且兩種巢式PCR法檢測出的陽性標(biāo)本一致。結(jié)論與濕片法相比,巢式PCR法檢測男性尿液標(biāo)本陰道毛滴蟲具有較高的靈敏度和特異性。

尿道炎;毛滴蟲,陰道;聚合酶鏈反應(yīng)

據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)報道[1],2008年陰道毛滴蟲病新發(fā)病例僅西太平洋地區(qū)就達(dá)4.57千萬,其中男性2.38千萬。目前實驗室檢查毛滴蟲的方法主要為濕片法,但敏感性低,且易受檢驗者水平的影響。培養(yǎng)法雖然是診斷毛滴蟲感染的金標(biāo)準(zhǔn),但操作麻煩,耗時較長,故不作為臨床常規(guī)檢查[2-3]。聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)法對尿拭子或尿液標(biāo)本均具有較高的敏感性和特異性[4-5],但巢式PCR與普通PCR法相比,通過設(shè)計外引物和內(nèi)引物,對目的基因進行兩輪特異性擴增,可進一步提高檢測結(jié)果的靈敏度和特異性[6]。鑒于以上原因,本研究參考相關(guān)文獻(xiàn),建立了兩種巢式PCR方法,對男性尿道炎患者的尿液標(biāo)本進行檢測,以期為臨床陰道毛滴蟲的檢測提供行之有效的方法。

對象與方法

一、研究對象

2011年4月至2013年12月,在中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病醫(yī)院性病門診就診的有尿道炎臨床表現(xiàn)的男性患者1 088例。病例選擇標(biāo)準(zhǔn):年齡≥18歲,有尿道分泌物和(或)尿痛,就診前未應(yīng)用抗滴蟲藥物。本研究通過中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn),患者簽署知情同意書。

二、主要試劑與儀器

淋球菌TM培養(yǎng)基(珠海迪爾生物工程有限公司),DNA提取液(美國Epicentre公司),PCR試劑盒[寶生物工程(大連)有限公司],核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)[生工生物工程(上海)股份有限公司],瓊脂糖(美國Life Technologies公司)。S1000型PCR儀、電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)(美國BioRad公司),高速低溫離心機(德國Eppendorf公司)。

三、方法

1.標(biāo)本采集:每例患者采集2根尿道拭子標(biāo)本,1根用于分泌物涂片鏡檢和淋球菌培養(yǎng),另1根用于陰道毛滴蟲濕片鏡檢[7];采集長時間(1 h以上)未排尿后的首段尿或清晨首次尿5～10 ml,分裝成1 ml/管后于-80℃保存,用于DNA提取。

2.陰道毛滴蟲濕片法檢測:將采集的拭子直接涂在滴有生理氯化鈉溶液的載玻片上,蓋上蓋玻片,用100倍、400倍顯微鏡觀察。

3.DNA提取:將-80℃凍存的尿液置37℃解凍,4℃離心3 min(12 000 r/min,離心半徑9.5 cm)。棄上清液后加200 μl DNA提取液,充分渦旋15 s,置65℃金屬浴15 min。再渦旋15 s,97℃金屬浴5 min。取出冷卻后離心取上清進行PCR檢測。

4.巢式PCR引物設(shè)計:TVC巢式PCR引物參考文獻(xiàn)[6],以陰道毛滴蟲重復(fù)基因組為目的基因,擴增片段約237 bp;BTuBx巢式PCR引物以陰道毛滴蟲β微管蛋白為目的基因,參考文獻(xiàn)[8]并運用Primer Premier 5.0生物軟件自行設(shè)計,擴增片段約134 bp。兩種陰道毛滴蟲巢式PCR引物序列見表1。

5.PCR檢測:配制50 μl PCR擴增體系,10×PCR 緩沖液(Mg2+Plus)5 μl,dNTPs(各 10 mmol/L)1 μl,引物(TVC3F/TVC4R 或 BTuBx1-Fa/BTuBx1-Ra)各 1 μl,Taq 酶(5 U/μl)0.25 μl,DNA 模板 5 μl,其余體積用滅菌蒸餾水補齊。每次檢測均設(shè)陽性對照(經(jīng)測序及BLAST比對驗證序列正確的PCR陽性男性尿液DNA)、陰性對照(無菌蒸餾水)。取0.5 μl第1輪擴增產(chǎn)物作為DNA模板,引物(TVC11F/TVC12R 或 BTuBx3-F/BTuBx3-Ra)各 1 μl,其余成分同上,進行第2輪擴增。第1輪或第2輪PCR擴增過程相同,均包括40個循環(huán):95℃變性1 min,52～55℃退火1 min,72℃延伸1 min。瓊脂糖凝膠電泳:配制2%瓊脂糖凝膠,加入1%EB溶液,制成約4 mm厚的瓊脂板,于電泳槽中電泳。電泳液為1×TAE溶液,電壓120 V,每孔上樣量10 μl。電泳后將瓊脂板置于紫外線下觀察,拍照記錄結(jié)果,擴增出相應(yīng)大小目的條帶即為陽性(圖1)。

表1 陰道毛滴蟲巢式PCR引物序列

6.核酸序列測定及分析:將陽性PCR產(chǎn)物送至北京博邁德生物技術(shù)有限公司進行序列測定,得到的核酸序列與GenBank中已知目的基因序列進行BLAST比對分析。

7.統(tǒng)計學(xué)處理:結(jié)果數(shù)據(jù)用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行Fisher精確概率法檢驗,P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、兩種巢式PCR擴增產(chǎn)物的鑒定

兩種巢式PCR產(chǎn)物經(jīng)測序分析以及BLAST比對,與GenBank中預(yù)期片段序列相似性達(dá)98%以上。

二、兩種巢式PCR法及濕片法的比較

圖1 陰道毛滴蟲巢式PCR瓊脂糖凝膠電泳圖譜 M:DNA Marker;1～3:待測標(biāo)本;4:陽性對照;5:陰性對照;A:TVC巢式PCR結(jié)果;B:BTuBx巢式PCR結(jié)果

采用兩種巢式PCR法及濕片法分別檢測了1 088例男性尿道炎患者尿液,結(jié)果濕片法的檢出率為0,而兩種巢式PCR法均檢測出29例陽性標(biāo)本,陽性率為2.67%,且兩種巢式PCR法檢測出的陽性標(biāo)本一致。以并聯(lián)法計算各實驗方法的靈敏度,即只要有一種方法檢測結(jié)果為陽性即認(rèn)定該標(biāo)本為陽性,濕片法靈敏度為0,兩種巢式PCR法靈敏度均為100%。以串聯(lián)法計算兩種巢式PCR法的特異度,即只有當(dāng)兩種巢式PCR均檢測為陽性時才認(rèn)定該標(biāo)本為陽性,兩種巢式PCR法的特異性均為100%。經(jīng)Fisher精確概率法檢驗分析,兩種巢式PCR法檢出率分別與濕片法比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。

討 論

陰道毛滴蟲病是世界范圍內(nèi)常見的性傳播疾病。但由于檢測技術(shù)的限制,以及超過77.3%的男性感染者無明顯臨床癥狀[9],使得人們習(xí)慣上認(rèn)為該病是女性陰道炎的常見病因,而對男性感染者的診斷與治療常常被忽視。我國性病門診中男性陰道毛滴蟲檢出率0～10.09%[10-12]。何康[13]對215例滴蟲性陰道炎女患者的男性配偶尿道分泌物進行陰道毛滴蟲濕片鏡檢,陽性率高達(dá)20%。

姚志遠(yuǎn)等[5]曾以培養(yǎng)法為金標(biāo)準(zhǔn),證實PCR法對尿道拭子或尿道液標(biāo)本均具有較高的敏感性和特異性。我們首次運用巢式PCR法進行男性尿道炎中陰道毛滴蟲的檢測。巢式PCR法與普通PCR法相比,通過設(shè)計外引物和內(nèi)引物,對目的基因進行兩輪特異性擴增,大大提高了檢測結(jié)果的靈敏度和特異性,尤其是對于臨床含有大量人體正?；蚨≡w含量過少的標(biāo)本,更是減少了漏檢的概率。本研究中巢式PCR檢測出29例陽性標(biāo)本,第1輪PCR的陽性檢出率僅為55.17%～58.62%(TVC引物及BTuBx引物第1輪分別檢出陽性標(biāo)本17例、16例,該數(shù)據(jù)未在上述結(jié)果中列出)。本研究中濕片法陽性檢出率為0。表明巢式PCR法與濕片法、普通PCR法相比,具有更高的靈敏度和特異性。

陰道毛滴蟲雖然不是男性尿道炎的常見原因,對于有尿道炎癥狀的男性患者如果經(jīng)驗性治療沒有效果,有條件時應(yīng)做滴蟲檢測。濕片法雖然快速簡便,但其敏感性低,增加了臨床漏檢的可能性,宜推廣靈敏度和特異性均高的PCR法檢測男性標(biāo)本中的陰道毛滴蟲。

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2014-03-19)

(本文編輯:顏艷)

Detection ofTrichomonas vaginalisin male patients with urethritis by nested PCR

Le Wenjing，Su Xiaohong，Li Sai，Liu Yurong，Zhang Jinping，Zhu Xiaofeng，Wang Baoxi.Institute of Dermatology，Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College，Nanjing 210042，China

Su Xiaohong，Email:suxhong@yahoo.com

ObjectiveTo establish two nested PCR assays for detection ofTrichomonas vaginalisin urine samples from male patients with urethritis，and to evaluate their diagnostic value.MethodsOne thousand and eighty-eight male patients with urethritis were enrolled from sexually transmitted disease(STD)clinic in the Hospital of Dermatology，Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College between April 2011 and December 2013.Urethral swabs were collected followed by smear testing，wet mount microscopic examination ofTrichomonas vaginalis，and cultivation ofNeisseria gonorrhoeae.Urine specimens were also obtained from these patients followed by DNA extraction.Two nested PCR assays were developed and performed to amplify the repeat genomic sequence and β-tubulin gene ofTrichomonas vaginalis.ResultsTrichomonas vaginaliswas detected in none of these swab specimens by wet mount microscopy，but in 29(2.67%)of the urine specimens by either of the two nested PCR assays.Moreover，the positive specimens detected by the two nested PCR assays were completely consistent.ConclusionCompared with wet mount microscopy，nested PCR has higher sensitivity and specificity in detection ofTrichomonas vaginalisin urine samples from male patients.

Urethritis;Trichomonas vaginalis;Polymerase chain reaction

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.12.004

美國國立衛(wèi)生研究院(NIH)國際合作項目(1-U19-AI084048)

210042南京,中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院皮膚病研究所

蘇曉紅,Email:suxhong@yahoo.com