盧仁泉,胡 娟,吳興中,郭 林＊

(1.復旦大學附屬腫瘤醫(yī)院檢驗科、復旦大學上海醫(yī)學院腫瘤學系,上海200032;2.復旦大學上海醫(yī)學院生物化學與分子生物學系)

近年來針對卵巢癌的腫瘤標志物方面的研究很多,至今CA125仍然臨床上應用最廣泛的卵巢癌血清標志物。但由于CA125的靈敏度僅為40%左右,而且在某些良性疾病中也會升高,大大限制它的臨床應用。2003年,Hellstrom研究發(fā)現(xiàn),人附睪上皮分泌蛋白4(human epididymis protein 4,HE4)可應用于卵巢癌的早期診斷,其敏感度與特異性均優(yōu)于CA125[1,2]。我們進行了HE4的克隆表達,希望能為進一步制備HE4診斷試劑奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞、質粒和菌株 人卵巢癌SKOV3細胞株由上海市腫瘤研究所惠贈。pUCm-T載體購自申能博彩公司,PET28a(+)表達載體由浙江大學動物預防醫(yī)學研究所惠贈。TOP10、BL21菌株由復旦大學上海醫(yī)學院生化與分子生物學實驗室提供。

1.2 主要試劑及工具酶 Trizol試劑、MMLV逆轉錄酶購自 Introvigen公司。dNTP、10×PCR buffer、Taq DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和 SalⅠ均為Takara生物公司產(chǎn)品。凝膠回收試劑盒由Genebase公司提供。質粒抽提試劑、抗His-Tag抗體購自天根生物公司。引物合成與測序由上海生工公司完成,引物序列為 P1:5′-accgggatccatgcctgcttgtcgcctagg-3′和P2:5′-acgcgtcgactcagaaattgggagtgacac-3′。其他主要試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 細胞培養(yǎng)及 RNA提取 人卵巢癌SKOV3細胞株用10%小牛血清在5%CO2、37℃條件下常規(guī)培養(yǎng),待細胞數(shù)量到達5×106時,用 Trizol試劑按操作說明書抽提總RNA。

1.4 RT-PCR擴增 HE4基因 利用25μlRT體系,即 RNA 2μl、OligdT 1μl、H2O 8.5μl,5 ×RT buffer 5 μl、2.5 mMdNTP 8μl,M-MLV 0.5μl;42℃30 min,99℃5 min,5℃5 min,得到 RT產(chǎn)物(cDNA)。50μl PCR體系:RT產(chǎn)物1μl,H2O 36μl,10×buffer 5μl,2.5mMdNTP 5μl,引物 P1、P2各 1μl,Taq聚合酶 1 μl。PCR反應條件為:94℃5 min;94℃30 s,60℃30 s,72℃45 s,35個循環(huán);72℃5min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖(Gibco公司)凝膠電泳分離與鑒定,并用凝膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物。

1.5 HE4基因重組測序質粒的構建 將4μl PCR產(chǎn)物與1μl PUCm-T載體在T4連接酶的作用下,16℃循環(huán)水浴連接4-5小時。連接產(chǎn)物轉化入感受態(tài)TOP10細菌中,涂布于含氨芐青霉素(100 mg/L)LB平板上,用 IPTG作為誘導劑,X-Gal作為生色劑,37℃16-24小時,形成藍白斑。挑取白色菌落,接種含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液,培養(yǎng)過夜。取部分菌液測序,并用質粒抽提試劑提取菌液中的重組質粒,進行雙酶切鑒定。

1.6 HE4基因重組表達質粒的構建 利用PET28a質粒為載體構建原核表達載體,根據(jù)PET28a質粒的多克隆位點,用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ,SalⅠ分別雙酶切PUCm-T-HE4和PET28a,凝膠回收得到HE4片段和酶切后的PET28a質粒,兩者同上(重組測序質粒構建的連接部分)連接后得到原核表達載體PET28a-HE4。將該PET28a-HE4質粒轉化入感受態(tài)表達菌E.coliBL21中,涂布于含卡那霉素(100 mg/L)的LB平板,37℃培養(yǎng)16-24小時,挑取菌落,轉種于含卡那霉素的LB培養(yǎng)液中進行培養(yǎng),抽提質粒進行雙酶切及測序鑒定。

1.7 HE4融合蛋白的表達及鑒定 從鑒定正確的上述LB培養(yǎng)液中取少量菌液,轉種后待細菌生長至A600為0.6左右時,加入異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)誘導蛋白的表達。我們進行誘導表達條件的優(yōu)化:在37℃和28℃兩個溫度條件下,分別加入IPTG使其終濃度為0.1,0.2,0.5和1.0 mmol/L進行目的蛋白的誘導表達,選擇最佳誘導條件。在最佳誘導條件下誘導后1,2,3,4和5 h經(jīng)SDS-PAGE鑒定HE4融合蛋白的表達量,確定最佳表達時間。然后收集細菌沉淀,用 PBS重懸后,經(jīng)超聲后取上清進行SDS-PAGE鑒定,以及利用抗His-Tag抗體進行Western blot鑒定。

2 結果

2.1 RT-PCR擴增 HE4基因 用 Trizol試劑抽提出總 RNA,再以 RNA為模板,特異性擴增 HE4基因,得到大小約為400 bp的DNA片斷。1%瓊脂糖凝膠電泳結果,見圖1。

圖1 HE4基因 RT-PCR產(chǎn)物電泳結果

2.2 重組測序質?？寺　y序

HE4基因的擴增產(chǎn)物與PUCm-T載體連接后轉化入TOP10菌,LB平板上生長出白色光滑菌落。白色菌落LB液培養(yǎng)后,抽提其中質粒,經(jīng)BamHⅠ、SalⅠ雙酶切結果,如圖2所示(400 bp左右處出現(xiàn)目的條帶)。測序結果也顯示重組質粒含有HE4基因。

2.3 HE4基因表達載體的構建

構建的PET28a-HE4重組表達質粒用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、SalⅠ雙酶切后,可產(chǎn)生400 bp左右的DNA片段(HE4基因片段),鑒定結果見圖3。測序的結果也表明已連接且連接順序也正確。

2.4 HE4基因表達及鑒定

上述的重組表達質粒PET28a-HE4轉化入BL21表達菌后經(jīng) IPTG誘導,表達出了 HE4融合蛋白。最佳誘導條件確定為在28℃條件加入的IPTG終濃度應為0.5mmol/L,最佳誘導時間為5 h。誘導表達的HE4融合蛋白 SDS-PAGE和western blot鑒定結果 ,見圖4。

3 討論

Kirchhoff等[3]最先在人的附睪上皮中克隆出HE4基因,其編碼精子成熟有關的蛋白酶抑制劑。該基因位于染色體20q12-13.1,全長為12 kb左右,由5個外顯子和4個內(nèi)含子組成,存在多種剪切方式,編碼分泌小分子蛋白,均含有高度保守的WAP(Whey Acidic Protein)結構域,該結構域含有8個半胱氨酸組成的4個二硫鍵核心區(qū)域,與細胞外蛋白酶抑制劑有很高的同源性[4]。1999年,Schummer[5]等運用cDNA array雜交技術分析了不同來源的卵巢癌及癌旁組織中的基因表達水平,發(fā)現(xiàn)HE4 mRNA在卵巢癌組織中高表達,但在癌旁組織中不表達。直至2003年,Hellstrom等[1]研究發(fā)現(xiàn)在大多數(shù)卵巢癌患者血清中的HE4蛋白量比正常人有明顯提高,證實該蛋白可作為臨床診斷卵巢癌的一個新指標。

圖2 重組質粒pUCm-T-HE4雙酶切產(chǎn)物電泳結果

圖3 重組表達質粒PET28a-HE4雙酶切產(chǎn)物電泳結果

圖4 HE4融合蛋白表達的SDS-PAG電泳及western blot鑒定結果

也有學者認為HE4可以與CA125聯(lián)合檢測來提高卵巢癌的診斷敏感性[6,7]。Moore等[7]在對幾種新型卵巢癌腫瘤標志物的臨床應用研究中發(fā)現(xiàn),單個腫瘤標志物測定時,HE4的敏感度最高,可達72.9%,對于早期腫瘤(臨床分期 I期),HE4是最好的單個標志物。而聯(lián)合檢測時,CA125、HE4聯(lián)合測定敏感性最高。

但是,目前國內(nèi)尚未見檢測HE4的注冊試劑盒供應,該項檢測在臨床上的研究也還未廣泛展開。為使該指標應用于臨床,得以早期發(fā)現(xiàn)卵巢癌,利用基因工程手段獲得HE4融合蛋白作為抗原,并從而研制出HE4檢測試劑盒,顯得尤為重要。

本研究工作采用RT-PCR技術從SKOV3細胞株總RNA中擴增到一條400 bp左右大小的DNA片斷,經(jīng)克隆后測序鑒定,證實此片斷為 HE4基因的序列。我們進一步將該 HE4基因與克隆載體PUCm-T進行連接,轉化入感受態(tài)的TOP10菌中,含重組質粒PUCm-T-HE4的TOP10菌生長出白色光滑菌落。挑選白色菌落轉種后,抽提出大量克隆的重組質粒,進行電泳鑒定以及克隆測序。測序結果表明HE4基因已成功克隆。再將該重組測序質粒和表達載體PET28a(+)均進行雙酶切后連接,轉化入BL21表達菌中誘導表達,后經(jīng)SDS-PAGE及western blot鑒定,結果表明可表達HE4融合蛋白且為可溶性高表達。確定的最佳誘導溫度為28℃,最佳誘導時間為5h左右,表達出的HE4融合蛋白,分子量在14 KD左右,而且該融合蛋白帶有 His標簽,大大方便了其進一步純化。

本研究獲得的HE4蛋白可用作抗原或者診斷試劑盒的標準品,為開發(fā)檢測卵巢癌的診斷試劑提供了原料保證。我們將進一步純化、免疫動物獲得抗體,為卵巢癌的診斷開辟新手段奠定基礎。

[1]Hellstrom I,Raycraft J,Hayden2Ledbetter M,et al.The HE4(WFDC2)protein is a biomarker for ovarian carcinoma[J].Cancer Res,2003,63(13):3695.

[2]Drapkin R,Von Horsten HH,Lin YF,et al.Human epididymis protein 4(HE4)is a secreted glycoprotein that isoverexpressed by serousand endometrioid ovarian carcinomas[J].Cancer Res,2005,65(6):2162.

[3]Kirchhoff C,Habben I,Ivell R,et al.A major human epididymis-specific cDNA encodes a protein with sequence homology to extracellular proteinase inhibitors[J].Biol Reprod 1991,45:350.

[4]Clauss A,Lilja H,Lundwall A.A locuson human chromosome 20 contains several genesexpressing protease inhibitor domainswith homology to whey acidic protein[J].Biochem J,2002,368:233.

[5]SchummerM,Wallap VN,Bumgarner RE,et al.Comparative hybridization of an array of 21500 ovarian cDNAs for the discovery of genes overexpressed in ovarian carcinomas[J].Gene,1999,238(1):375.

[6]Rosen DG,Wang L,Atkinson JN,etal.Potentialmarkers that complement expression of CA125 in epithelial ovarian cancer[J].Gynecol Oncol 2005,99(2):267.

[7]Moore RG,Brown AK,Miller MC,et al,The use ofmultiple novel tumor biomarkers for the detection of ovarian carcinoma in patientswith a pelvic mass[J].Gynecol Oncol,2008,108(2):402.