張靜春,石曉群,林 偉,榮墨克*

(1.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 檢驗(yàn)科,吉林 長(zhǎng)春 130033;2.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院放療科,吉林 長(zhǎng)春 130033;3.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 康復(fù)科,吉林 長(zhǎng)春 130033)

自動(dòng)分析方法測(cè)定血漿維生素C

張靜春1,石曉群2,林 偉3,榮墨克1*

(1.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 檢驗(yàn)科,吉林 長(zhǎng)春 130033;2.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院放療科,吉林 長(zhǎng)春 130033;3.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 康復(fù)科,吉林 長(zhǎng)春 130033)

*通訊作者

維生素C(Vitamin C,Vc)是人體內(nèi)重要的水溶性氧化劑,其作用是清除體內(nèi)自由基,防止及降低致病基因的突變,減少生物協(xié)同因子和基質(zhì)的作用[1-3]。血清Vc的水平反映人體內(nèi)生物反應(yīng)的變化過(guò)程,對(duì)估價(jià)體內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)水平有重要參考價(jià)值。Vc的測(cè)定方法有HPLC和化學(xué)法等[4,5],均不適于臨床常規(guī)應(yīng)用,通過(guò)應(yīng)用抗壞血酸氧化酶使抗壞血酸變成脫氫抗壞血酸,與鄰苯二胺呈顯色反應(yīng),用自動(dòng)生化分析儀,快速,準(zhǔn)確地測(cè)定血漿Vc含量。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 Beckman Synchron CX9自動(dòng)生化分析儀?？箟难?AA),抗壞血酸氧化酶(AO),鄰苯二胺(OPDA),偏磷酸(MPA),二硫蘇糖醇(DTT)均購(gòu)自Sigma公司,磷酸氫二鈉,磷酸二氫鈉購(gòu)自北京化工廠。

1.2 試劑配制 ①蛋白沉淀劑貯存液(MPA 5.0 mol/L/DTT 51.2 mmol/L):稱(chēng)取MPA 400 g,DTT 800 mg加水至 100 ml;蛋白沉淀劑應(yīng)用液(MPA 500 mmol/L/DTT 5.12 mmol/L):將貯存液用蒸餾水稀釋10倍。②抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)貯存液(2.84 mmol/L):精確稱(chēng)取AA 50 mg,加MPA/DTT液至 100 ml;抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液:將貯存液用MPA/DTT液稀釋成283、113、56.6 和 5.68 μ mol/L。 ③磷酸鹽緩沖液(0.10 mol/L):稱(chēng)取NaH2PO41.155 g,Na2HPO4?7H2O 388.5 mg,加80 ml蒸餾水,調(diào)酸堿度至pH 6.5,再以蒸餾水稀釋至100 ml。④抗壞血酸氧化酶貯存液(200 kU/L):按購(gòu)買(mǎi)的AO活性單位以磷酸鹽緩沖液溶解AO至200 kU/L;抗壞血酸氧化酶應(yīng)用液(8 kU/L):取100 μ l貯存液以2.4 ml磷酸鹽緩沖液稀釋。⑤顯色劑(OPDA 4.6 mmol/L/DTT 0.6 mmol/L):稱(chēng)取OPDA 50 mg以磷酸鹽緩沖液溶解至100 ml,調(diào)pH 6.5,加 DTT 9.25 mg,混合溶解。

1.3 方法 ①標(biāo)本采集及處理以肝素抗凝真空采血管取靜脈血3 ml,放置10 min,分離血漿,取血漿500 μ l加MPA/DTT 液 50 μ l。混合 30 s,1500轉(zhuǎn)離心10 min,取上清液待用。

②儀器操作1)裝試劑將抗壞血酸氧化酶應(yīng)用液裝入試劑盒的C瓶中,將顯色劑裝入試劑盒的A瓶中。2)Beckman Synchron CX 9自動(dòng)生化分析儀維生素C測(cè)定操作參數(shù)設(shè)定見(jiàn)表1。

2 結(jié)果

2.1 方法的精確性 取濃度為114 μ mol/L和28.3 μ mol/L高低兩種的AA標(biāo)準(zhǔn)品各30份,作精確性試驗(yàn),批內(nèi)變異分別為:5.2%和4.5%。批間變異分別為:7.6%和4.1%。

2.2 方法的準(zhǔn)確性 取濃度分別為5.68 μ mol/L、56.6 μ mol/L 、113 μ mol/L 、170 μ mol/L 、283 μ mol/L 的AA標(biāo)準(zhǔn)品,加入血漿中,測(cè)定其回收率,結(jié)果分別為 :95.4%、95.6%、96.1%、102%、106%。

2.3 方法的線性 取濃度分別為5.68 μ mol/L、56.6 μ mol/L 、113 μ mol/L 、170 μ mol/L 、283 μ mol/L 的AA標(biāo)準(zhǔn)品作線性測(cè)定,濃度為 5.68 μ mol/L-283 μ mol/L間有良好的線性關(guān)系,其直線方程為y=1.021 x+0.003,r=0.998。

表1 CX9自動(dòng)生化分析儀Vc測(cè)定參數(shù)

2.4 干擾性試驗(yàn) 取血漿分別加入膽紅素800 μ mol/L 、1600 μ mol/L;甘油三脂 10 g/L 、20 g/L;血紅蛋白1.5 g/L、3.0 g/L。膽紅素和甘油三脂對(duì)Vc結(jié)果沒(méi)有影響,血紅蛋白1.5 g/L時(shí)對(duì)結(jié)果沒(méi)有影響,當(dāng)濃度為3.0 g/L時(shí)使結(jié)果偏低15%。

2.5 參考值范圍 選取體檢健康成人50名,男35名,年齡23-57歲。女15名,年齡25-52歲。其參考值范圍為:29.1-92.3 μ mol/L。

3 討論

常用的Vc測(cè)定方有HPLC法和顯色法,前者的特異性和準(zhǔn)確性較好,但用時(shí)較長(zhǎng),不適合臨床常規(guī)應(yīng)用;后者特異性和準(zhǔn)確性較差,且預(yù)處理時(shí)間亦很長(zhǎng)。兩者都不能應(yīng)用自動(dòng)分析方法快速測(cè)定。我們采用AO將Vc氧化生成DHAA,后者與OPDA反應(yīng),應(yīng)用BeckmanSynchron CX9自動(dòng)生化分析儀測(cè)定,該儀器通過(guò)應(yīng)用程序的設(shè)定可自動(dòng)標(biāo)定標(biāo)準(zhǔn),自動(dòng)測(cè)定空白,并自動(dòng)計(jì)算出結(jié)果。本法簡(jiǎn)便,快速,準(zhǔn)確,可用于血漿和尿液的測(cè)定,適于臨床常規(guī)應(yīng)用。

顯色劑OPDA除了與DHAA反應(yīng),還與其它的氧化型物質(zhì)反應(yīng),因此,在自動(dòng)分析中先將血漿與OPDA反應(yīng)作為空白測(cè)定,然后加入AO,再測(cè)定氧化后的DHAA,結(jié)果減去空白得到Vc含量。因血中的AA和DHAA同樣具有生物活性,空白中除了排除了干擾物質(zhì),同時(shí)也排除了血漿中原有的DHAA,因此,該方法測(cè)定的只是AA,不包括DHAA。由于血中的DHAA只占總AA的5%左右,故不影響臨床意義。

由于Vc強(qiáng)還原劑在空氣中極易氧化,應(yīng)以真空采血管取血,然后立即送檢,離心后加入蛋白沉淀劑和穩(wěn)定劑。為準(zhǔn)確測(cè)定穩(wěn)定內(nèi)環(huán)境的Vc,應(yīng)于晨空腹采血。尿液Vc測(cè)定將尿液稀釋5倍同血漿測(cè)定。

診斷Vc缺乏的較為準(zhǔn)確的試驗(yàn)為Vc飽和試驗(yàn),即口服或靜脈注射一定量的Vc,于一定的時(shí)間留取尿液,測(cè)定其Vc的含量。該方法有很多測(cè)定方式,其Vc的用量和尿液留取的時(shí)間均不同,由于尿液的留取過(guò)程容易造成Vc成份的變化,故盡量縮短留取尿液的時(shí)間,較為理想的Vc飽和試驗(yàn)為:靜脈注射Vc 0.5 g,于4小時(shí)留取尿液,排出量為40%為正常。排出量20%以下為缺乏。

[1]李美茹,劉秀芬.維生素C的作用[J].生物學(xué)教學(xué),2006,31(10):75.

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[4]莫海濤,杜玉蘭,黎慶濤,等.反相高效液相色譜法測(cè)定發(fā)酵飲料中有機(jī)酸和維生素C的含量[J].食品工業(yè)科技,2007,2:230.

[5]李秋菊,王亞紅,劉秀萍.維生素C測(cè)定方法[J].太原師范學(xué)院學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2005,4(1):89.

1007-4287(2010)01-0140-02

張靜春(1965-),男,主管技師,從事臨床生化檢驗(yàn)及研究工作。

2009-01-06)