張文雋，吳亞召，雷 萍，孫悅迎

（陜西省微生物研究所，陜西 西安 710043）

桑黃Phellinus igniarius(L.ex Fr.)Quel.，屬擔(dān)子菌亞門(mén)，是火木層孔菌 （P.igniarius）、鮑氏針層孔菌 （P.baumii）和裂蹄針層孔菌 （P.linteus）的俗稱(chēng)，生長(zhǎng)于楊、桑、柳、白樺、櫸和桃等闊葉樹(shù)的枯立木、立木及樹(shù)干上[1]。

自1968年，日本學(xué)者Ikekaw等發(fā)現(xiàn)，桑黃野生子實(shí)體的提取物對(duì)小鼠肉瘤S180的抑制率為96.7%[2]。目前對(duì)桑黃的藥用功能進(jìn)行了廣泛研究，發(fā)現(xiàn)桑黃具有抗腫瘤、抗氧化、抗菌等藥理作用[3]，是國(guó)際公認(rèn)生物治癌領(lǐng)域有效率排在第一的藥用真菌，已成為該研究領(lǐng)域的一個(gè)熱點(diǎn)。桑黃活性成分多糖是從子實(shí)體中提取，受生理生態(tài)特殊性及環(huán)境條件制約，自然形成的子實(shí)體稀少，人工栽培難度較大。所以，桑黃的開(kāi)發(fā)和利用也受到限制。為了解決這個(gè)難題，本試驗(yàn)對(duì)其液體發(fā)酵工藝進(jìn)行了研究，初步篩選出適宜菌絲體生長(zhǎng)的液體培養(yǎng)基配方，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)桑黃菌產(chǎn)品提供了技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

樺樹(shù)桑黃菌種來(lái)自于陜西省微生物研究所微生物資源中心3室。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 母種培養(yǎng)基

采用PDA綜合培養(yǎng)基。

1.2.2 碳源測(cè)定基礎(chǔ)培養(yǎng)基

蛋白胨0.5%、KH2PO40.1%、MgSO40.05%、VB110 mg·100－1·mL－1， pH 自然。

1.2.3 氮源測(cè)定基礎(chǔ)培養(yǎng)基

葡萄糖2%、 KH2PO40.1%、 VB11 mg·100－1·mL－1、MgSO40.05%、，pH自然。

1.2.4 試驗(yàn)培養(yǎng)基

將碳源基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的葡萄糖分別以蔗糖、乳糖、麥芽糖、可溶性淀粉、玉米粉取代，進(jìn)行碳源試驗(yàn)；將氮源測(cè)定基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的蛋白胨分別以酵母膏、 (NH4)2SO4、麥麩、黃豆粉、尿素代替進(jìn)行氮源試驗(yàn)。

1.2.5 優(yōu)化培養(yǎng)基

試驗(yàn)以玉米粉 （A）、葡萄糖 （B）為復(fù)合碳源，以麥麩 （C）、蛋白胨和酵母膏 （D）為復(fù)合氮源，采取四因素三水平正交試驗(yàn)的方法，對(duì)樺樹(shù)桑黃菌絲體液體培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化。

1.2 護(hù)理質(zhì)量管理 質(zhì)量管理是指確定質(zhì)量方針、目標(biāo)和職責(zé)，并在質(zhì)量體系中通過(guò)諸如質(zhì)量策劃、質(zhì)量控制、質(zhì)量保證和質(zhì)量改進(jìn)，使其實(shí)施全部管理職能的所有活動(dòng)。護(hù)理質(zhì)量管理是指按照護(hù)理質(zhì)量形成的過(guò)程和規(guī)律，對(duì)構(gòu)成護(hù)理質(zhì)量的各要素進(jìn)行計(jì)劃、組織、協(xié)調(diào)和控制，以保證護(hù)理服務(wù)達(dá)到規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)和滿足服務(wù)對(duì)象需要的活動(dòng)過(guò)程。

1.3 方法

1.3.1 固體培養(yǎng)方法

按PDA綜合培養(yǎng)基配方配制，高壓滅菌后制斜面，無(wú)菌條件下接種樺樹(shù)桑黃菌菌種塊0.3 cm2，在28℃條件下恒溫培養(yǎng)至斜面長(zhǎng)滿，得一級(jí)菌種備用。

1.3.2 碳源篩選試驗(yàn)

取一級(jí)樺樹(shù)桑黃菌菌種0.5 cm2，分別接種于6種不同碳源培養(yǎng)基中，于28℃條件下靜置培養(yǎng)16 d，每次試驗(yàn)重復(fù)5次，結(jié)果取平均值。

1.3.3 氮源篩選試驗(yàn)

取一級(jí)樺樹(shù)桑黃菌菌種0.5 cm2，分別接種于7種不同氮源培養(yǎng)基中，于28℃條件下靜置培養(yǎng)16 d，每次試驗(yàn)重復(fù)5次，結(jié)果取平均值。

1.3.4 菌絲生長(zhǎng)量的測(cè)定

發(fā)酵液用紗布過(guò)濾后，菌絲體用清水沖洗干凈，置70℃烘箱烘干至恒重，稱(chēng)量。

1.3.5 正交試驗(yàn)篩選最佳培養(yǎng)基配方

取一級(jí)樺樹(shù)桑黃菌菌種0.5 cm2，分別接種于9種不同的正交試驗(yàn)培養(yǎng)基中，于29℃條件下靜置培養(yǎng)16 d，每次試驗(yàn)重復(fù)5次，結(jié)果取平均值。試驗(yàn)因素及其各水平見(jiàn)表1。

表1 L9(34)正交試驗(yàn)的因素及水平設(shè)計(jì)

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基成分對(duì)菌絲產(chǎn)量的影響

2.1.1 碳源的篩選試驗(yàn)

在碳源基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別加入各種碳源2%，進(jìn)行碳源的篩選試驗(yàn)，試驗(yàn)重復(fù)5次，取菌絲干重平均值。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 不同碳源對(duì)樺樹(shù)桑黃發(fā)酵菌絲生長(zhǎng)量的影響

從表2可以看出，樺樹(shù)桑黃以玉米粉作為碳源效果最好，其次是葡萄糖、蔗糖等。

2.1.2 氮源篩選試驗(yàn)

在氮源基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別加入各種氮源0.5%，進(jìn)行氮源的篩選試驗(yàn)，試驗(yàn)重復(fù)5次，取菌絲干重平均值。結(jié)果見(jiàn)表3。

從表3可以看出，樺樹(shù)桑黃最適發(fā)酵用氮源為麥麩，其次是黃豆粉、蛋白胨、 (NH4)2SO4等。

表3 不同氮源對(duì)樺樹(shù)桑黃發(fā)酵菌絲生長(zhǎng)量的影響

2.1.3 正交試驗(yàn)結(jié)果與直觀分析

L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果直觀分析結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果直觀分析表

從表4可以看出9個(gè)處理中，處理2的菌絲干重最大14.85 g·L-1，由此得出較優(yōu)的樺樹(shù)桑黃發(fā)酵培養(yǎng)基配方為玉米粉1%、麥麩1%、葡萄糖2%、蛋白胨0.5%、酵母膏0.5%、 磷酸二氫鉀 0.1%、 維生素 B11 mg·100-1·mL-1、 硫酸鎂0.05%。處理6次之，處理3、處理4較差。

3 討論

通過(guò)該篩選試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，樺樹(shù)桑黃菌絲體最適碳源是玉米粉，最適發(fā)酵用氮源為麥麩。葡萄糖也可作為發(fā)酵碳源，但玉米粉價(jià)格低廉，本試驗(yàn)選擇玉米粉做發(fā)酵碳源。

采用正交方法優(yōu)化出了樺樹(shù)桑黃菌絲體發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)基配方。結(jié)果表明，玉米粉1%、麥麩1%、葡萄糖2%、蛋白胨0.5%、酵母膏0.5%、磷酸二氫鉀0.1%、硫酸鎂0.05%、 維生素 B11 mg·100-1·mL-1。

[1]卯曉嵐.中國(guó)大型真菌[M].河南：河南科技出版社，2000.

[2]Shihata S,Nishiawa Y,Mai CF,et al.Anti-tumor stuies on some extracts of Basidiomycetes[J].Gann,1968(59):159-161.

[3]張萬(wàn)國(guó).桑黃抗肝纖維化及其作用機(jī)理的研究[D].上海：第二軍醫(yī)大學(xué)，2002.