宋曉聰,楊芳芳,胡 丹,曲 彥

熱休克蛋白 (heat shock proteins,HSPs)是生物體或離體培養(yǎng)細(xì)胞在熱應(yīng)激等不良環(huán)境下由熱休克基因編碼產(chǎn)生的一組具有高度保守性的應(yīng)激蛋白,廣泛存在于原核細(xì)胞和真核細(xì)胞中。在熱休克蛋白家族中,熱休克蛋白 70(heat shock protein 70,HSP70)家族是最保守、最豐富,也是研究最為深入的一種[1]。在腦卒中、顱腦創(chuàng)傷等所致的腦缺血再灌注過程中,腦缺血缺氧引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)所產(chǎn)生的大量氧自由基是引起腦損傷的主要原因之一[2]。目前,如何保護(hù)神經(jīng)組織免受氧化應(yīng)激損傷成為醫(yī)學(xué)研究的一個重要課題。本實(shí)驗(yàn)以重組腺病毒介導(dǎo)外源性 HSP70在體外培養(yǎng)的神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá),再以過氧化氫 (H2O2)誘導(dǎo)細(xì)胞損傷作為細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的模型,觀察外源性 HSP70表達(dá)對 H2O2所致神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞毒性的影響,以探討 HSP70是否具有抗氧化的神經(jīng)保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 主要材料和試劑 重組腺病毒 vAd-HSP70和腺病毒載體對照 vAd-GFP由本課題組構(gòu)建并保存[3]。乳酸脫氫酶(LDH)檢測試劑盒購于南京建成科技有限公司;鼠抗人HSP70單克隆抗體購于美國 Santa Cruz生物技術(shù)公司;辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠 IgG和羊抗兔 IgG購于北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.2 體外神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng) 取出生時間 ＜24 h的新生昆明種小鼠 (購自青島市藥品檢驗(yàn)所),在無菌條件下斷頭取大腦皮質(zhì),去除軟腦膜,剪碎皮質(zhì),經(jīng)消化、離心,加培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液,接種于 75 cm2培養(yǎng)瓶,置 37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。具體過程參見文獻(xiàn) [4]。靶細(xì)胞主要為神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞。

1.3 感染靶細(xì)胞及氧化應(yīng)激模型的建立

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組 對照組包括正常細(xì)胞對照組 (未感染組)和腺病毒對照組 (vAd-GFP感染組);實(shí)驗(yàn)組為重組腺病毒vAd-HSP70感染組。病毒感染組在感染 48 h時經(jīng) 0.5 mol/L H2O2處理,同時未感染組也給予氧化應(yīng)激處理。

1.3.2 感染靶細(xì)胞 體外培養(yǎng)神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞達(dá) 70%～80%融合時,棄去培養(yǎng)液,用 PBS洗細(xì)胞單層一次,接種 200 μl低溫保存的重組腺病毒懸液,37℃吸附 30 min,加維持液繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3.3 氧化應(yīng)激模型 將 30%H2O2用無血清 DMEM稀釋成終濃度為 0.5 mmol/L的處理液,現(xiàn)配現(xiàn)用。將 3組細(xì)胞在無菌條件下棄去培養(yǎng)液,加入配好的處理液,液體完全覆蓋靶細(xì)胞作用 1 h。之后,棄去處理液,PBS沖洗 1次,加入正常培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng) 24 h后做相應(yīng)檢測。

1.4 病毒感染靶細(xì)胞效應(yīng)的檢測 采用 RT-PCR檢測靶細(xì)胞中 HSP70轉(zhuǎn)錄,Western blotting檢測靶細(xì)胞中 HSP70蛋白表達(dá),MTT檢測細(xì)胞增殖。

1.4.1 RT-PCR檢測靶細(xì)胞中 HSP70轉(zhuǎn)錄 收集病毒感染48 h后的各組細(xì)胞,Trizol一步法提取細(xì)胞總 RNA,按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒要求的標(biāo)準(zhǔn)條件合成 cDNA用作 PCR模板。利用Primier primer 5.0引物設(shè)計軟件設(shè)計擴(kuò)增 HSP70編碼基因的特異性引物,上游引物 5′-CGGGTACCCAACGACGGAGACAGCC-3′, 下游引物 5′-GCGATATCTCCAGCCACGAGATGACC-3′,擴(kuò)增產(chǎn)物長度為 1 486 bp。PCR反應(yīng)體系及擴(kuò)增條件參見文獻(xiàn) [4]。取5μl PCR擴(kuò)增產(chǎn)物于 0.8%的瓊脂糖凝膠 (含0.5 mg/L溴化乙錠)中電泳,凝膠自動成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。

1.4.2 Western blotting檢測靶細(xì)胞中 HSP70蛋白表達(dá) 重組腺病毒感染靶細(xì)胞 48 h后收集細(xì)胞,用裂解液 (400μl RIPA+4μl PMSF)提取細(xì)胞總蛋白,取 50μg蛋白上樣行 SDSPAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉,依次加抗 HSP70抗體 (1∶500稀釋)、兔抗鼠抗體 (1∶500稀釋)作用,最后 X線片曝光、顯影和定影后觀察結(jié)果。

1.4.3 MTT檢測細(xì)胞增殖 制備 1×106個 /ml的對數(shù)生長期細(xì)胞懸液接種于 96孔細(xì)胞培養(yǎng)板,每孔 200μl。細(xì)胞過夜貼壁后每孔接種病毒 2μl,vAd-GFP感染組和 vAd-HSP70感染組均設(shè) 3個平行孔,以無細(xì)胞培養(yǎng)液孔作為對照孔。經(jīng)氧化應(yīng)激處理后各孔加 10μl MTT溶液 (5 mg/ml),37℃繼續(xù)培養(yǎng) 4 h,每孔加 150μl二甲基亞楓 (DMSO)終止反應(yīng),振蕩10 min,用酶標(biāo)檢測儀在 490 nm波長下測定吸光度 (A)值。測定 3次取平均值。

1.4.4 LDH活力檢測 取對數(shù)生長期細(xì)胞,接種于 24孔培養(yǎng)板,細(xì)胞過夜貼壁后每孔接種重組腺病毒 5μl,根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組,每組均設(shè) 6個平行孔,各組經(jīng)氧化應(yīng)激處理后24 h,收集培養(yǎng)上清液,檢測 LDH活力,取 6次檢測值的平均值。

1.4.5 電鏡檢測細(xì)胞超微結(jié)構(gòu) 將各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞經(jīng) H2O2處理后收集,固定、脫水、常規(guī)包埋、超薄切片、染色后在透射電鏡下觀察、拍照。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用 SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理,數(shù)據(jù)以 (x±s)表示,3組均值間的比較采用方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 靶細(xì)胞中重組腺病毒 vAd-HSP70的表達(dá) 倒置熒光顯微鏡觀察可見重組腺病毒感染靶細(xì)胞 48 h后感染率達(dá) 80%(見圖1)。RT-PCR檢測結(jié)果顯示重組腺病毒 vAd-HSP70感染組可觀察到 HSP70編碼基因 1 486 bp的特異性擴(kuò)增帶;而未感染組和 vAd-GFP感染組細(xì)胞無此條帶 (見圖 2)。Western blotting檢測結(jié)果顯示重組腺病毒 vAd-HSP70感染組出現(xiàn)HSP70蛋白條帶;而未感染組和 vAd-GFP感染組細(xì)胞相應(yīng)位置無特異條帶 (見圖3)。

2.2 HSP70表達(dá)對靶細(xì)胞活力的影響 H2O2氧化應(yīng)激處理后,用 MTT法檢測各組的吸光度值以間接反映細(xì)胞活力,連續(xù)檢測 6 d。vAd-HSP70感染組細(xì)胞活力始終高于其他兩組(P＜0.01,見表 1),表明細(xì)胞有較強(qiáng)的生長能力。從第 4天起,vAd-GFP感染組和未感染組細(xì)胞逐漸凋亡 (見圖 4)。

圖 1 重組腺病毒感染 48 h后的靶細(xì)胞Figure 1 The target cellsinfected by recombinant adenovirus at 48 h A:vAd-HSP70 infected target cells;B:vAd-GFP infected target cells

2.3 LDH活性變化 各組細(xì)胞氧化應(yīng)激處理 24 h后,vAd-HSP70感染組培養(yǎng)液中 LDH活性為 (976±106),低于 vAd-GFP感染組和未感染組 〔分別為 (1 332±197)和 (1 380±121)〕,差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜0.01),而 vAd-GFP感染組和未感染組培養(yǎng)液中 LDH活性間差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (P＞0.05)。

2.4 透射電鏡下觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化 透射電鏡下觀察經(jīng) H2O2處理后各組細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化。vAd-HSP70感染組細(xì)胞的胞膜較清晰完整,細(xì)胞核致密,核膜清晰,其形態(tài)與正常對照細(xì)胞接近。vAd-GFP感染組和未感染組細(xì)胞的胞膜邊界不清,細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)空泡,核仁松散甚至核仁組分分離,部分細(xì)胞可見細(xì)胞核裂解等不可逆性損傷 (見圖 5)。

圖 2 RT-PCR檢測神經(jīng)元中 HSP70的表達(dá)Figur e 2 HSP70 expression in neuronal cells detected by RT-PCR lane 1:PCR marker DL2000;lane 2:positive control(Hela cells);lane 3:vAd-HSP70 infected neuronal cells;lane 4:vAd-GFPinfected neuronal cells;lane 5:uninfected neuronal cells control

圖 3 Western blotting檢測神經(jīng)元中 HSP70的表達(dá)Figure 3 HSP70 expression detected by Western blotting in neuronal cells Lane 1:positive control(MCF-7 cells);Lane 2:vAd-HSP70infected neuronal cells;lane 3:vAd-GFP infected neuronal cells;Lane 4:uninfected neuronal cells control

圖 4 HSP70表達(dá)對靶細(xì)胞增殖能力的影響Figure 4 The effect of HSP70 expression on target cell proliferation

圖 5 透射電鏡觀察各組細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化 (×10 000倍)Figur e 5 The changesof the ultrastructure of cells observed with the transmission electron microscope A:neuronal cells control;B:vAd-HSP70 infected neuronal cells;C:vAd-GFP infected neuronal cells;D:uninfected neuronal cells control

表 1 MTT檢測各組細(xì)胞的活力 (x±s)Table 1 Viability of cells tested by MTT

3 討論

氧化應(yīng)激是缺血再灌注引起組織損傷的主要原因之一,而腦組織對缺血缺氧最為敏感,耐受性差。此外,臨床上有許多神經(jīng)退行性疾病如脊髓側(cè)索硬化癥、帕金森病、阿爾茨海默病等都被認(rèn)為與氧化應(yīng)激損傷有關(guān)[5]。近年來,通過高熱預(yù)處理誘導(dǎo)內(nèi)源性 HSP的表達(dá)以探討 HSP的細(xì)胞保護(hù)作用的研究較多。Joyeux等[6]研究表明高熱預(yù)處理可以抵抗大鼠心肌的缺血再灌注損傷。體外實(shí)驗(yàn)也證明高熱預(yù)處理對 H2O2所致的心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷具有保護(hù)作用[7]。張廣雄等[8]研究表明高熱預(yù)處理對神經(jīng)元的氧化應(yīng)激損傷有保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)通過成功誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的神經(jīng)元中外源性 HSP70的表達(dá),來探討外源性 HSP是否同樣具有抗氧化應(yīng)激的保護(hù)作用。

成功誘導(dǎo)外源性 HSP表達(dá)成為本研究的關(guān)鍵。本研究采用重組腺病毒為載體將外源性 HSP70編碼基因?qū)氚屑?xì)胞,該載體系統(tǒng)具有構(gòu)建簡單,宿主廣泛,感染效率高,特異性強(qiáng),安全性好等特點(diǎn)。由于重組腺病毒攜帶 GFP的編碼基因,因此可在包裝增殖的同時直接用熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染及感染效率。且重組腺病毒 vAd-HSP70能有效感染小鼠原代神經(jīng)元,用 RT-PCR和 Western blotting在重組腺病毒 vAd-HSP70感染的神經(jīng)元均可檢測到 HSP70的表達(dá),而未感染組和 vAd-GFP感染組的神經(jīng)元未檢測到 HSP70的表達(dá),表明重組腺病毒能在靶細(xì)胞中有效表達(dá)。

MTT可反映細(xì)胞內(nèi)線粒體內(nèi)膜琥珀酸脫氫酶的活性,從而反映線粒體的功能,因此,被廣泛用作細(xì)胞呼吸和活力的指標(biāo),反映線粒體的整體功能。線粒體是細(xì)胞供能的場所,其功能喪失意味著細(xì)胞死亡,因此同等條件下 MTT檢測吸光度值大小可以反映細(xì)胞活力的高低。各組細(xì)胞經(jīng) H2O2處理后,對照組細(xì)胞的活力明顯下降,與 vAd-GFP感染組比較,重組腺病毒 vAd-HSP70感染組細(xì)胞仍有較強(qiáng)的活力;表明重組腺病毒介導(dǎo)的外源性 HSP70表達(dá)能維持線粒體的整體功能,從而抵抗 H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷,起到細(xì)胞保護(hù)作用。

LDH是細(xì)胞內(nèi)的標(biāo)志酶。細(xì)胞受損時,細(xì)胞膜通透性升高,細(xì)胞內(nèi) LDH釋放至細(xì)胞上清液,且釋放量與細(xì)胞受損程度呈正相關(guān),因此通過檢測細(xì)胞上清液中 LDH釋放量即可反映細(xì)胞受損情況。LDH的檢測結(jié)果顯示,各組細(xì)胞經(jīng) H2O2處理后,對照組的細(xì)胞培養(yǎng)上清液中 LDH活力明顯增加。這表明 H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷能導(dǎo)致細(xì)胞膜的損傷;而 vAd-HSP70感染組細(xì)胞培養(yǎng)液中 LDH活力則較低,提示外源性HSP70在靶細(xì)胞中的表達(dá)能增強(qiáng)細(xì)胞膜的穩(wěn)定性,對細(xì)胞起到保護(hù)作用。由此可見,HSP70過表達(dá)可顯著減輕神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的程度。

各種原因?qū)е碌哪X組織缺血缺氧損傷,都伴隨大量氧自由基的產(chǎn)生,氧自由基能夠直接損傷多種細(xì)胞器從而使細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。電鏡結(jié)果顯示,H2O2作用 1 h后,vAd-HSP70感染組細(xì)胞的胞膜完整,核仁致密,核膜清晰,大多數(shù)細(xì)胞線粒體清晰可見;而其他兩組細(xì)胞損傷明顯,大量細(xì)胞的胞膜界限不清,線粒體腫脹,核仁松散甚至核仁組分分離,部分細(xì)胞可見細(xì)胞核裂解等不可逆性損傷。電鏡結(jié)果與 MTT及LDH檢測結(jié)果相符合,這也能夠進(jìn)一步解釋 H2O2處理后第 1天 vAd-HSP70感染組細(xì)胞活力就明顯大于其他兩組細(xì)胞的原因。

綜上所述,重組腺病毒 vAd-HSP70介導(dǎo)的外源性 HSP70基因在體外培養(yǎng)的神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)可以起到抗氧化應(yīng)激的作用。這與 Yenari等[9]研究結(jié)果一致,其采用嗜神經(jīng)性單純皰疹病毒作為載體將 HSP70基因?qū)肽X卒中、心跳停止和中毒等實(shí)驗(yàn)動物模型中,結(jié)果顯示外源性 HSP70高表達(dá)可提高神經(jīng)元的存活率,能抵抗不同原因所致的腦損傷。本課題組的研究也表明,腺病毒介導(dǎo)的外源性 HSP70表達(dá)可保護(hù)體外培養(yǎng)的神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞抵抗缺氧再復(fù)氧損傷,具有明確的細(xì)胞保護(hù)作用[4]。然而目前,對外源性 HSP70具體的作用機(jī)制仍不明確。于如同等[10]實(shí)驗(yàn)顯示,高熱預(yù)處理可以減少氧化應(yīng)激神經(jīng)元一氧化氮 (NO)的產(chǎn)生,從而起到神經(jīng)保護(hù)作用。大量研究表明,應(yīng)激狀態(tài)下,HSP70可在細(xì)胞內(nèi)不同的部位定位,如線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細(xì)胞骨架等,以發(fā)揮其抗損傷的作用[11-12]。在應(yīng)激狀態(tài)下,核仁的結(jié)構(gòu)與功能會發(fā)生改變,HSP70可向核仁移位從而減輕氧化應(yīng)激所致細(xì)胞核仁損傷[13-14]。這一機(jī)制與本研究結(jié)果一致。高熱預(yù)處理誘導(dǎo)內(nèi)源性 HSP70表達(dá)對細(xì)胞的保護(hù)作用機(jī)制與外源性 HSP70的作用機(jī)制是否一致,這一問題需要進(jìn)一步的研究。

本課題組成功構(gòu)建了攜帶 HSP70基因的重組腺病毒,并能在靶細(xì)胞中有效地表達(dá),且進(jìn)一步證實(shí)了重組腺病毒介導(dǎo)的HSP70表達(dá)在神經(jīng)元中有明顯的抗缺氧及抗氧化應(yīng)激作用。這為以后的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。

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