周 震，王遵來，王秀云，孟向文，尚秀葵

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院針灸部，天津 300150；2.天津市北辰北門醫(yī)院，天津 300400；3.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193）

頸椎病是由于頸椎間盤退變而引起的一種血管、脊髓和神經(jīng)功能障礙性疾病，其發(fā)生機制與頸椎間盤外周炎癥病理網(wǎng)絡(luò)鏈中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，即炎性因子的表達具有密切關(guān)系。本研究在前期對“四天穴”針方臨床試驗的基礎(chǔ)上，通過對動靜力失衡性頸椎病模型大鼠頸椎間盤中炎性因子基因含量的檢測，初步探索該針方延緩頸椎病椎間盤退變的作用，為其臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康6月齡Wistar雄性大鼠60只，體質(zhì)量（200±20）g。由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供（動物許可證號：SCXK（京）2002-0003）。

1.2 主要試劑 Tripure試劑（Boehringer Mannhein公司產(chǎn)品）；SuperScript RTs試劑盒（Gibco公司產(chǎn)品）；焦碳酸二乙酯（Diethylpyrocarbonate，DEPC，Sigma公司產(chǎn)品）；脫氧核苷三磷酸（dNTP，Phermacia公司產(chǎn)品）；TaqDNA聚合酶及緩沖系統(tǒng)。目的基因及內(nèi)參基因β-actin引物序列均購自上海生工生物科技公司，序列如下：目的基因IL-1β（擴增長度245 bp）5’-CTC CATGAG CTT TGT ACAAGG-3’，5’-TGCTGA TGT ACC AGT TGG GG-3’；iNOS（擴增長度 317 bp）5’-CCA AGA ACG TGT TCA CCATG-3’，5’-GAT GTC CAG GAA GTA GGT GAG G-3’；內(nèi)參基因 β-actin（擴增長度 764 bp）5’-TTG TAA CCA ACT GGG ACG ATA TGG-3’，5’-GAT CTT GAT CTT CAT GGT GCT AG-3’。

1.3 動物分組 采用隨機數(shù)字表法將大鼠分為4組，即假手術(shù)組、模型組、四天穴針刺組、夾脊穴針刺組，每組各15只。每組再分為治療1、2、4周，共計3個時間點，每個時間點各5只。

1.4 動靜力失衡性頸椎病模型大鼠的制備 采用上海中醫(yī)藥大學(xué)脊柱病研究所造模方法[1]，重復(fù)建立動靜力失衡性頸椎病模型。

1.5 治療方法 大鼠腧穴定位根據(jù)中國針灸學(xué)會實驗針灸研究會制定的《動物針灸穴位圖譜》并結(jié)合比較解剖學(xué)進行。針刺選穴：四天穴針刺組選取雙側(cè)天鼎、天窗、天容、天牖穴。夾脊穴針刺組選取C3～C6頸夾脊穴。針刺操作時，四天穴針刺組將大鼠置于麻醉罐中95%乙醚淺麻醉后固定，大鼠頸后部剪毛、消毒，所有穴位均為直刺，深度至頸椎椎體表面，施捻轉(zhuǎn)提插手法強刺激30 s后出針，1次/d。夾脊穴針刺組麻醉、固定、剪毛、消毒同四天穴組，所有穴位均為45度角斜刺，沿C3～C6夾脊肌外側(cè)至頸椎椎體表面，施捻轉(zhuǎn)提插手法強刺激30 s后出針，1次/d。

1.6 取材及保存 大鼠急性失血法處死后，于4倍手術(shù)顯微鏡下沿上、下軟骨終板與椎體的交界面完整取下C3～C4、C5～C6椎間盤，其中C3～C4椎間盤投入4%多聚甲醛水溶液固定液瓶中，C5～C6椎間盤放入Eppendorf管，迅速投入液氮中保存。

1.7 實驗方法及觀察指標

1.7.1 形態(tài)學(xué)觀察 C3～C4椎間盤采用固定、切片、HE染色后，在100 X線學(xué)顯微鏡下對大鼠椎間盤組織形態(tài)觀察，每個標本取連續(xù)5張切片，按Miyanmoto等[2]的分級標準將頸椎間盤分為1～5級，具體分級標準見表1。

表1 Miyanmoto椎間盤分級標準Tab.1 Miyanmoto classification standard of cervical disc

1.7.2 分子生物學(xué)檢測 C5～C6椎間盤采用分子生物學(xué)逆轉(zhuǎn)錄-聯(lián)合酶鏈式反應(yīng)（RT-PCR）法檢測。根據(jù)標準RT-PCR操作流程：Trizol法提取頸椎間盤組織中總RNA；RNA變性電泳；逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)（RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA）；多聚酶鏈反應(yīng)（反應(yīng)條件：94℃預(yù)熱 2 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 45 s，72 ℃ 60 s，35 個循環(huán)；72℃延伸10 min）；凝膠電泳；用密度掃描儀對特異性條帶進行密度掃描。檢測頸椎間盤中白介素-1β（IL-1β）及 iNOSmRNA 表達。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計學(xué)分析，所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差（one-way ANOWA）分析。

2 結(jié)果

2.1 各實驗組頸椎間盤退變程度（IDDG）比較 見表2。

表2 各實驗組頸椎間盤退變程度（IDDG）比較(±s)Tab.2 Comparison of the degree of intervertebral disc degeneration in the intervertebral disc in each groups(±s)

表2 各實驗組頸椎間盤退變程度（IDDG）比較(±s)Tab.2 Comparison of the degree of intervertebral disc degeneration in the intervertebral disc in each groups(±s)

注：經(jīng)單因素方差分析，與假手術(shù)組同項目比較，★P<0.05，★★P<0.01；與模型組同項目比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01；夾脊穴針刺組間，與1周比較，犖P<0.05；四天穴針刺組間，與 1 周比較，△P<0.05，△△P<0.01。

組別假手術(shù)組模型組夾脊穴針刺組四天穴針刺組n5555治療1周1.20±0.454.00±0.71★★3.20±0.45★★▲3.60±0.55★★▲治療2周1.40±0.554.20±0.45★2.80±0.84★▲▲2.60±0.89★▲▲△治療4周1.20±0.454.20±0.84★2.20±0.45★▲▲犖2.20±0.45★▲▲△△

2.2 各實驗組頸椎間盤IL-1βmRNA表達結(jié)果 見表3。

表3 各實驗組頸椎間盤IL-1βmRNA表達結(jié)果比較(±s)Tab.3 comparison of the expression IL-1β mRNA in the Intervertebral disc in each groups(±s)

表3 各實驗組頸椎間盤IL-1βmRNA表達結(jié)果比較(±s)Tab.3 comparison of the expression IL-1β mRNA in the Intervertebral disc in each groups(±s)

注：經(jīng)單因素方差分析，與模型組同項目比較，★★P<0.01；與四天穴位針刺組同項目比較，△P<0.05；夾脊穴針刺組間，與1周比較，☆P<0.05；與 2 周比較，▲P<0.01；四天穴針刺組間，與 1周比較，犖P<0.05；與 2 周比較，▲P<0.05。

組別假手術(shù)組模型組夾脊穴針刺組四天穴針刺組n5555治療1周1.202±0.0271.222±0.1330.816±0.067★★△0.750±0.140★★治療2周0.177±0.0381.084±0.6170.685±0.144★★△☆0.502±0.192★★犖治療4周1.20±0.454.20±0.84★2.20±0.45★▲▲犖2.20±0.45★▲▲△△

2.3 各實驗組頸椎間盤iNos mRNA表達結(jié)果 見表4。

表4 各實驗組頸椎間盤iNos mRNA表達結(jié)果(±s)Tab.4 Comparison of the expression iNOS mRNA in the intervertebral disc in each groups(±s)

注：經(jīng)單因素方差分析，與模型組比較，★★P<0.01；夾脊穴針刺組間，與1周比較，☆P<0.01；與2周比較，茛P<0.05；四天穴針刺組間，與1 周比較，犖P<0.05；與 2 周比較，▲P<0.05。

組別假手術(shù)組模型組夾脊穴針刺組四天穴針刺組n5555治療1周0.100±0.0291.136±0.1090.780±0.099★★0.633±0.110★★治療2周0.073±0.0251.014±0.1750.474±0.116★★☆0.504±0.119★★犖治療4周0.051±0.0220.911±0.1650.339±0.077★★☆茛0.347±0.114★★犖▲

3 討論

越來越多的證據(jù)表明，在椎間盤退變—炎癥反應(yīng)—根性痛網(wǎng)絡(luò)鏈中，炎癥損傷起了更為主要的作用。一些生化介質(zhì)參與了這種改變，其中尤以IL-1的作用引人注目。IL-1β是一種重要的前炎性細胞因子，可誘導(dǎo)細胞間黏附分子的表達，并介導(dǎo)了中性粒細胞和單核細胞的聚集和浸潤。其作為椎間盤退變過程的潛在始動因素，對其退變過程的影響是多環(huán)節(jié)的，既可通過誘導(dǎo)金屬蛋白酶（MMPs）和一氧化氮（NO）促進髓核中蛋白聚糖（PG）的分解及抑制PG合成，導(dǎo)致PG的凈丟失而影響退變本身，也可通過其他炎性介質(zhì)影響其繼發(fā)性病理過程[3]。

此外，突出的椎間盤還可自發(fā)分泌NO，IL-1可刺激其進一步分泌。NO除抑制PG合成外，還是一種新的炎癥介質(zhì)和神經(jīng)遞質(zhì)，不但具有極強的擴張血管和增加血管通透性的作用。而且在炎癥反應(yīng)中也起重要作用，同時能增強傷害性感受器的敏感性，參與椎間盤退變所導(dǎo)致的神經(jīng)根痛病理過程。

“四天穴”針方為導(dǎo)師劉公望教授長期臨床經(jīng)驗總結(jié)，主要包括天鼎、天窗、天容、天牖四穴，均位于頸項部，分別屬手陽明、手太陽、手少陽經(jīng)穴。正如“經(jīng)脈所過，主治所及”，四穴合用可激發(fā)經(jīng)絡(luò)之氣，使氣至病所，疏經(jīng)活血通絡(luò)而達治療目的。該針方經(jīng)10余年長期大量臨床觀察，證明其療效確切，可有效改善患者的臨床癥狀，且預(yù)后良好[4-7]。

本研究通過Miyanmoto椎間盤分級標準評價“四天穴”針方對頸椎間盤組織形態(tài)學(xué)的影響，結(jié)果顯示，模型組、“四天穴”針刺組及夾脊穴針刺組3組均有不同程度退變的表現(xiàn)，模型組退變程度最重，其余針刺兩組退變程度較輕，其中“四天穴”針刺組退變程度最輕。初步判定，“四天穴”針方能有效改善頸椎間盤退變的形態(tài)學(xué)改變。

同時，采用分子生物學(xué)RT-PCR法觀察該針法對椎間盤中IL-1βmRNA及iNOSmRNA表達的影響。吸光度掃描（IOD）分析，與模型組比較，四天穴針刺組及夾脊穴針刺組對頸椎間盤中炎癥因子IL-1β及iNOS基因表達都有一定程度的抑制作用，且在4周時IOD數(shù)值均值最小，統(tǒng)計學(xué)上有顯著性差異（P<0.05）；兩針刺組間比較有顯著性差異（P<0.05）；表明四天穴針刺組要明顯優(yōu)于夾脊穴針刺組；四天穴針刺組間比較，在1、2及4周3個時間相中，2周組、4周組均顯著低于1周組，4周組也顯著低于2周組。結(jié)果表明，針刺“四天穴”針方能降低模型大鼠頸椎間盤內(nèi)炎性因子IL-1βmRNA、iNOSmRNA的表達，具有抑制外周炎性因子的作用。且隨著治療時間的延長，“四天穴”針法的治療效果越來越明顯，這也與在前期臨床觀察中及上述實驗中得到的結(jié)果是一致的。

[1] 王擁軍，施 祀，沈培芝，等.動靜力失衡性大鼠椎間盤退變模型的動態(tài)觀察[J].中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2001，21（3）：199-200.

[2] Miyanmoto S,Yoneenobu K,Keiro O.Experimental cervical spondylosis in the mouse[J].Spine,1991,15(510):495-500.

[3] 姜 杰.IL-1與椎間盤退行性病變[J].頸腰痛雜志，2000，10（4）：339-340.

[4] 王秀云，劉公望.針刺四天穴方治療神經(jīng)根型和椎動脈型頸椎病療效觀察[J].針灸臨床雜志，2003，19（2）：41-44.

[5] 尚秀葵，胡明海，孟 紅.針刺“四天”穴為主治療頸肩綜合癥[J].中國針灸，1998，4：284-286.

[6] 尚秀葵，孟向文.針刺“四天”穴為主治療神經(jīng)根型頸椎病臨床觀察[J].中國針灸，2002，22（11）：732-734.

[7] 董洪英，劉公望.針“四天”穴為主治療頸源性眩暈的臨床療效觀察[J].針灸臨床雜志，2005，21（7）：41-42.