李棣華，劉俊紅，伍孝先

（天津市南開醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合急腹癥研究所，天津 300100）

《中國(guó)藥典》（2005版）規(guī)定供藥用的柴胡為傘形科柴胡或狹葉柴胡功能具有和解退熱、疏肝解郁、升舉陽(yáng)氣。為中醫(yī)治療少陽(yáng)證的首選中藥。筆者通過建立柴胡多糖的含量測(cè)定方法及測(cè)定11個(gè)不同產(chǎn)地的柴胡中多糖含量，以便初步考察不同產(chǎn)地柴胡有關(guān)多糖含量方面的質(zhì)量狀況。

1 儀器與試藥

UV—160型SHIMADZU紫外分光光度儀；十萬(wàn)分之一天平Sartorius BP211D;無水葡萄糖對(duì)照品（批號(hào)：110833-200302）購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所；試劑均為分析純；

2 方法[1]與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取無水葡萄糖對(duì)照品22.60 mg，置于25 mL容量瓶中，加蒸餾水使溶解，稀釋至刻度，搖勻；精密吸取上述溶液3.0 mL，置于25 mL容量瓶中，加蒸餾水至刻度，搖勻即得對(duì)照品溶液。

2.2 對(duì)照品溶液最大吸收波長(zhǎng)測(cè)定 精密吸取無水葡萄糖對(duì)照品溶液，按標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下操作，于200～800 nm進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，無水葡萄糖在487 nm處有最大吸收，故確定檢測(cè)波長(zhǎng)為487 nm。

2.3 線性關(guān)系考察 精密吸取對(duì)照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL 分別置于 10 mL 容量瓶中，分別加蒸餾水至1.0mL，再分別加入5%苯酚1.6mL，混勻，然后加濃硫酸7.0 mL，混勻，放置10 min，再于冷水中冷卻15 min，加水至刻度，搖勻，隨行空白，于487 nm處測(cè)定吸光度；以葡萄糖重量為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得回歸方程為：C＝16.259ABS－0.0169，r＝0.9986，表明無水葡萄糖在10.848～75.936 μg 之間線性關(guān)系良好。

2.4 供試品溶液的制備方法考察

2.4.1 乙醇回流次數(shù)考察 取柴胡粉末0.25 g，精密稱定，置于100 mL圓底燒瓶中，每次加入乙醇50 mL，按設(shè)定提取次數(shù)水浴回流提取，每次1 h，濾過，濾液棄去。殘?jiān)鼡]干乙醇，連同濾紙一起加入60 mL蒸餾水，回流提取1 h，濾過，用熱水洗滌殘?jiān)?次，定容至100 mL容量瓶中，搖勻。再精密吸取5.0 mL置于25 mL容量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度，搖勻即可，按標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下操作進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果提取次數(shù)分別為1、2、3次時(shí)，多糖含量分別為65.993、62.985、61.689 g/kg生藥。根據(jù)結(jié)果，同時(shí)考慮操作時(shí)間，以提取2次為宜。

2.4.2 水提取用量考察 取柴胡粉末0.25 g，精密稱定，置于100mL圓底燒瓶中，每次加入乙醇50mL，水浴回流提取2次，每次1 h，濾過，濾液棄去。殘?jiān)鼡]干乙醇，連同濾紙一起加入按設(shè)定用量蒸餾水，回流提取1 h，以下同2.4.1操作。結(jié)果水用量分別為45、60、75 mL 時(shí)，多糖含量分別為 59.824、62.985、60.539 g/kg生藥。結(jié)果表明水提取用量以60 mL為佳。

2.4.3 水提取時(shí)間考察 取柴胡粉末0.25 g，精密稱定，置于100mL圓底燒瓶中，每次加入乙醇50mL，水浴回流提取2次，每次1 h，濾過，濾液棄去。殘?jiān)鼡]干乙醇，連同濾紙一起加入60 mL蒸餾水，按設(shè)定回流時(shí)間提取，以下同2.4.1操作。結(jié)果提取時(shí)間分別為 0.5、1.0、1.5 h，多糖含量分別為 60.097、62.985、63.282 g/kg生藥。結(jié)果表明，水提取時(shí)間以1.5 h為佳。

2.4.4 結(jié)論 根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)可確定柴胡藥材多糖供試品溶液制備的主要步驟為乙醇回流提取2次，殘?jiān)尤?0 mL蒸餾水，水提取1.5 h。

2.5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精密吸取無水葡萄糖對(duì)照品溶液，按標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下操作，每30 min測(cè)定吸光度，共測(cè)定5次。柴胡多糖吸光度的相對(duì)均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)±偏差值（RSD）為0.69%，說明供試品溶液在2 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 按照供試品溶液制備方法，取同批柴胡藥材，制備6份供試品溶液，按標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下操作測(cè)定，柴胡多糖含量的RSD%為3.08%。

2.7 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 取已知含量柴胡藥材，按照供試品溶液制備方法制備6份，加入適量對(duì)照品溶液，按標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下操作測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率結(jié)果（n=6）Tab.1 Results of spotting recovery（n=6）

2.8 樣品含量測(cè)定 按2.4項(xiàng)下制備11種不同產(chǎn)地柴胡藥材供試品溶液，平行取樣3份，按標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下操作測(cè)定，計(jì)算多糖含量。結(jié)果見表2。

3 討論

柴胡多糖的加樣回收率實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，柴胡藥材中加入無水葡萄糖進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)，測(cè)定值比理論值減少近50%，經(jīng)分析表明無水葡萄糖溶于95%乙醇中，乙醇提取時(shí)損失。曾采用先以95%乙醇提取柴胡藥材，再加入無水葡萄糖進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)，結(jié)果回收率仍不合格，為找原因進(jìn)行了無水葡萄糖耐熱實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)無水葡萄糖損失率達(dá)62.94%。表明無水葡萄糖對(duì)熱不穩(wěn)定。因此本實(shí)驗(yàn)采用在最后定容時(shí)加入無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行加樣回收率實(shí)驗(yàn)。

表2 柴胡藥材多糖含量測(cè)定結(jié)果（n=3）Tab.2 Results of quantification of polysaccharide（n=3）

在實(shí)驗(yàn)過程中，發(fā)現(xiàn)柴胡多糖供試品放置一定時(shí)間后含量下降，經(jīng)分析認(rèn)為可能是供試品中含有的細(xì)菌分解多糖之故。供試品經(jīng)蒸汽滅菌后，再進(jìn)行穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示含量穩(wěn)定，表明上述假設(shè)正確。這提示含多糖的樣品若需要一定時(shí)間后在測(cè)定或進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，必須滅菌保存。

[1] 余 暉,陸兔林.柴胡不同炮制品多糖含量測(cè)定[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，1997，8（5）：447-448.