柳占彪，師詠梅，許 放，史 紅，張少卓，胡利民

（天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，天津市中藥藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300193）

骨關(guān)節(jié)炎（OA）是一種多因素引起的以關(guān)節(jié)軟骨退行性變?yōu)榛静±砀淖兊募膊?。延緩關(guān)節(jié)軟骨退變和促進(jìn)透明軟骨再生是防治OA的關(guān)鍵。目前尚缺乏根治OA的特異性藥物。痹祺膠囊是天津達(dá)仁堂京萬(wàn)紅藥業(yè)有限公司研制生產(chǎn)，用于治療骨性關(guān)節(jié)炎的一種中藥制劑，由黨參、丹參、白術(shù)、茯苓、馬錢(qián)子等組成，具有益氣養(yǎng)血，祛風(fēng)除濕、活血止痛的功能，經(jīng)多年臨床使用證實(shí)對(duì)骨性關(guān)節(jié)炎有確切療效，癥狀改善明顯，并獲持續(xù)性改進(jìn)，有效率達(dá)98.87%，但缺乏痹祺膠囊治療骨性關(guān)節(jié)炎的基礎(chǔ)研究，作用機(jī)制不清。本實(shí)驗(yàn)觀(guān)察痹祺膠囊對(duì)大鼠膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨組織的影響。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物 雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量（200±10）g，購(gòu)自天津市山川紅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司。許可證號(hào)：SCXK（津）2009－0001。

1.2 藥物 痹祺膠囊：天津京萬(wàn)紅藥業(yè)股份有限公司（批號(hào)：301510）。木瓜蛋白酶：博士德公司進(jìn)口分裝（Sigma）（批號(hào)：118K1465）。

1.3 試劑 福爾馬林、酒精、二甲苯、石蠟、染料等。

1.4 儀器 BMJ-1生物組織包埋機(jī)、LEICARM 2135切片機(jī)、OLYMPUS照相顯微鏡。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 造模[1]選雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量（200±10）g，按0.3 mL/100 g腹腔注射10%的水合氯醛，麻醉后，大鼠雙側(cè)膝關(guān)節(jié)注射4%木瓜蛋白酶，每側(cè)0.2 mL，隔3 d 1次，連續(xù)3次。

2.2 分組及給藥 選模型大鼠40只，隨機(jī)分為模型組、痹祺膠囊1.296 g/kg組、0.648 g/kg組和0.324 g/kg組，每組10只。另取10只，作為健康對(duì)照。在第3次造模完成后的第1天用痹祺膠囊開(kāi)始灌胃給藥，正常組和模型組每只大鼠灌胃等量生理鹽水，連續(xù)治療6周。主動(dòng)脈放血致死，取膝關(guān)節(jié)，用10%福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋，蘇木-伊紅（HE）染色，光鏡下觀(guān)察關(guān)節(jié)的病理變化。

2.3 病理學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn) 見(jiàn)表1。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所得數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS11.5軟件進(jìn)行分析，各組數(shù)據(jù)之間比較采用秩和檢驗(yàn)（K-S檢驗(yàn)），以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 健康對(duì)照組 10只大鼠雙側(cè)膝關(guān)節(jié)均未出現(xiàn)病理改變，膝關(guān)節(jié)軟骨結(jié)構(gòu)完整，軟骨表面光滑，切線(xiàn)層軟骨細(xì)胞呈梭形、平行排列于表面；移行層和深層軟骨細(xì)胞呈圓形或卵圓形，柱狀排列，鈣化層可見(jiàn)少量細(xì)胞和藍(lán)染的鈣化基質(zhì)。見(jiàn)圖1。

3.2 模型組 10只大鼠有14/20個(gè)關(guān)節(jié)出現(xiàn)病理改變，病理改變主要表現(xiàn)為軟骨表面局部粗糙不平或出現(xiàn)裂隙，或缺失形成潰瘍。軟骨組織壞死，呈均質(zhì)紅染，失去原有結(jié)構(gòu)，壞死區(qū)殘留少量軟骨細(xì)胞。壞死面積大小不等，有的至移行層，有的至鈣化層或軟骨下骨。有的病例壞死組織脫落，形成潰瘍。在壞死區(qū)兩側(cè)可見(jiàn)軟骨基質(zhì)水腫，染色不一，軟骨細(xì)胞變性、排列紊亂，大小不一，有的軟骨細(xì)胞簇狀排列；少數(shù)病例滑膜有輕度增生和炎細(xì)胞浸潤(rùn)。此外，有2例出現(xiàn)軟骨下骨髓纖維化，并在關(guān)節(jié)有大量纖維組織增生，見(jiàn)圖1。

表1 骨關(guān)節(jié)炎軟骨組織病理學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Tab.1 An assessment grading standard of OA cartilage histopathology 分

3.3 痹祺膠囊治療組 1.296、0.648、0.324 g/kg 3個(gè)治療組在病變發(fā)生率、病變范圍和病變嚴(yán)重程度方面與模型組比較均有降低或減輕。見(jiàn)表2、表3、表4。此外，從高、低劑量組大鼠觀(guān)察到有少數(shù)病例在壞死區(qū)有呈簇狀增生的軟骨細(xì)胞和纖維組織的增生。見(jiàn)圖1。

由表2、表3、表4可知，健康對(duì)照組10只大鼠關(guān)節(jié)軟骨組織均未出現(xiàn)病理改變，模型組大鼠關(guān)節(jié)的病變發(fā)生率較高，病變范圍大，病變較重，用痹祺膠囊治療的模鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織在水腫、變性、簇聚和壞死方面均輕于模型組，3個(gè)給藥組（1.296 g/kg、0.648 g/kg、0.324 g/kg）病理學(xué)總評(píng)分分別為41.5分、13.5分、19.0分，均低于模型組（57.5分）。其中軟骨細(xì)胞的壞死例數(shù)占總例數(shù)的百分比分別為64.%、30%、30%（模型組70%），病理學(xué)評(píng)分為12.5分、6.5分、3.5分（模型組29.0分），經(jīng)秩和檢驗(yàn)（K-S），0.648g/kg、0.324 g/kg治療組與模型組差異有非常顯著意義（P＜0.01），結(jié)果表明痹祺膠囊對(duì)大鼠關(guān)節(jié)軟骨組織的壞死具有一定的保護(hù)作用。

表2 痹祺膠囊對(duì)大鼠關(guān)節(jié)軟骨病變發(fā)生率的影響Tab.2 BEffect of Biqi Capsule on the incidence of cartilage pathological changes in rats

表3 痹祺膠囊對(duì)大鼠關(guān)節(jié)軟骨不同病變發(fā)生率的影響Tab.3 Effect of Biqi Capsule on the incidence of different pathological changes of cartilage in rats

表4 痹祺膠囊對(duì)OA大鼠關(guān)節(jié)軟骨組織影響的病理學(xué)評(píng)價(jià)Tab.4 Effect of Biqi Capsule on the histopathologic assessment of cartilage in rats with on OA 分

4 討論

木瓜蛋白酶是一種蛋白水解酶,將其注入大鼠膝關(guān)節(jié)后可溶解軟骨基質(zhì)中的蛋白多糖和膠原纖維，造成軟骨基質(zhì)的結(jié)構(gòu)破壞，軟骨細(xì)胞因失去膠原纖維網(wǎng)架結(jié)構(gòu)的保護(hù)而退變、壞死。本實(shí)驗(yàn)造模結(jié)果顯示造模后關(guān)節(jié)軟骨正常結(jié)構(gòu)消失，軟骨壞死、軟骨表面出現(xiàn)裂縫甚至部分缺失，證明該法可以獲得成功OA的動(dòng)物模型，此模型接近臨床骨關(guān)節(jié)炎。但在本實(shí)驗(yàn)中未見(jiàn)有骨贅形成，這一結(jié)果與鄧宇[2]、馬建兵[3]的研究結(jié)果相同?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為骨性關(guān)節(jié)炎的病理過(guò)程為軟骨細(xì)胞生物功能減退或變異，軟骨基質(zhì)蛋白多糖生物合成和分解異常，從而導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨局部軟化、磨損及結(jié)構(gòu)破壞，關(guān)節(jié)軟骨的改變是骨關(guān)節(jié)炎的根本病理表現(xiàn)。中醫(yī)則認(rèn)為本病的發(fā)生發(fā)展關(guān)鍵在于肝腎虧虛、正氣虛弱，這是本病發(fā)生的病理基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，痹祺膠囊對(duì)關(guān)節(jié)軟骨的壞死具有一定的保護(hù)作用，這為痹祺膠囊治療骨性關(guān)節(jié)炎提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。這種作用可能是由于痹祺膠囊的益氣養(yǎng)血，祛風(fēng)除濕、活血止痛功能，加快了關(guān)節(jié)局部的血液循環(huán)，通過(guò)滑液的滲透代謝，增強(qiáng)了受損組織的營(yíng)養(yǎng)供給和有害代謝產(chǎn)物的及時(shí)清除，從而保護(hù)了軟骨細(xì)胞遭受進(jìn)一步的損傷，使其得以修復(fù)。痹祺膠囊消腫活血的作用可從趙景文[4]的研究結(jié)果得到證實(shí)。此外，從高、低劑量組大鼠觀(guān)察到有少數(shù)病例在軟骨細(xì)胞壞死區(qū)仍有呈簇狀增生的軟骨細(xì)胞存在，而且生長(zhǎng)活躍，這種新生的軟骨細(xì)胞是否還具有軟骨細(xì)胞的生理功能，是否為藥物促進(jìn)的作用，尚不能確定，有待進(jìn)一步深入研究。

[1] 胡愛(ài)心，陳廖斌，汪 暉，等.黃芪多糖對(duì)大鼠骨關(guān)節(jié)炎的影響[J].武漢大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2008，29（2）：157-161.

[2] 鄧 宇，伍筱梅，任醫(yī)民，等.關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射不同蛋白酶建立兔膝骨關(guān)節(jié)炎模型的對(duì)比研究 [J].中華關(guān)節(jié)外科雜志，2009，3（3）：332-339.

[3] 馬建兵，沙浩渡，李向陽(yáng),等.兔實(shí)驗(yàn)性膝骨性關(guān)節(jié)炎的組織病理學(xué)及發(fā)病機(jī)理[J].中國(guó)外科矯形雜志，2001，8(1)：45-47.

[4] 趙景文,袁雪海,趙連根.痹祺膠囊對(duì)足跖腫脹及肢體血流作用的研究[J].中草藥，1999，30（9）：686-687.