安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院內(nèi)分泌科(合肥 230001)張 麗 李素梅 葉山東 翟 斐 章 容

糖尿病腎病(Diabetic nephropathies,DN)是糖尿病最常見和最嚴(yán)重的慢性并發(fā)癥之一,細(xì)胞因子在DN發(fā)病中的作用越來越受到人們關(guān)注。國(guó)外不少研究表明,醛固酮拮抗劑安體舒通能夠減輕腎臟的炎癥反應(yīng),減輕腎小球硬化,延緩 DN的進(jìn)展,但其具體機(jī)制不清。本實(shí)驗(yàn)就安體舒通對(duì) 2型糖尿病大鼠腎臟的保護(hù)作用進(jìn)行觀察,并著重從影響細(xì)胞因子 mcp-1表達(dá)的角度探討其可能機(jī)制。

材料與方法

1 材 料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康 SD大鼠 30只,雄性,2月齡,體重 150±20g,由安徽省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 藥物和試劑 鏈脲佐菌素(美國(guó) Sigma公司),安體舒通(杭州民生藥業(yè)集團(tuán)有限公司),視黃醇結(jié)合蛋白酶聯(lián)免疫試劑盒(上海德波生物技術(shù)有限公司),白蛋白放射免疫試劑盒(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院協(xié)和醫(yī)學(xué)科技有限公司),尿 MCP-1 ELISA試劑盒(Bio Source International Inc,美國(guó) ),Trizol和 PCR試劑盒(Fermentas,立陶宛)。引物合成于上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司,序列如下:MCP-1的上游引物為 5′-CACCTGCTGCTACTCATTCACT-3′,下游 引物 為5′-GTTCTCTGTCATACTGGTCACT TC-3′,目 的片段 為 349bp; GAPDH的 上 游 引 物 為 5′-TCCCTCAAGATTGTCAGCAA-3′,下游引物為 5′-AGATCCACAAACGGATACAT T-3′,目 的 片 段 為308bp。

1.3 主要儀器設(shè)備 英國(guó) DREW公司 DS-5型糖化血紅蛋白檢測(cè)儀,安徽合肥眾成機(jī)電公司 DFM-96型 10管放射免疫γ計(jì)數(shù)儀,江蘇南京國(guó)營(yíng)華東電子管廠 DG-3022A型酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀,美國(guó) Nano-Drop公司 ND1000紫外 /分光光度儀,德國(guó) biometra PCR儀。

2 方 法

2.1 2型糖尿病大鼠模型的制備及分組

2.1.1 飲食誘導(dǎo)胰島素抵抗:普通雄性 SD大鼠30只,體重 150～ 170g。 隨機(jī)分成兩組:對(duì)照組 (n=10),喂以常規(guī)飼料;模型組(n=20),喂以高糖高脂飼料 (常規(guī)飼料加 20% 蔗糖、10% 豬油、2.5% 膽固醇)。飼養(yǎng) 5個(gè)月,測(cè)空腹血糖(FBG)及血漿胰島素水平 (FINS),并計(jì)算胰島素敏感性指數(shù):ISI=-In(1/FBG×FINS)。血標(biāo)本在 1% 戊巴比妥麻醉下(30mg/kg)從心臟采取。血糖測(cè)定采用美國(guó) One TouchⅡ血糖儀和試紙條,胰島素測(cè)定采用成都市華西糖尿病科技開發(fā)研究所的免疫活性胰島素放射免疫試劑盒。

2.1.2 小劑量鏈脲佐菌素(STZ)注射誘導(dǎo)糖尿病:高糖高脂飲食 5個(gè)月后,模型組動(dòng)物腹腔多次性(最多 3次)注射 STZ 25 mg/kg(溶解于新鮮配制的 0.1 mol/L枸櫞酸緩沖液中,pH值為 4.2)。對(duì)照組動(dòng)物僅注射等量枸櫞酸緩沖液。注射后 1周測(cè)非空腹血糖及胰島素值,并作胰島素抑制試驗(yàn),以 60 min、90 min和 120 min 3點(diǎn)血糖及胰島素平均值作為穩(wěn)態(tài)血糖(Steady state plasma glucose,SSPG)、穩(wěn)態(tài)血胰島素(Steady state plasma insulin,SSPI)值,以衡量胰島素敏感性的程度。

2.1.3 動(dòng)物分組及給藥方法:以非空腹血糖≥11.0mmo1/L,伴胰島素敏感性降低兩條件作為 2型糖尿病模型成功標(biāo)準(zhǔn)。將模型組模型成功動(dòng)物(n=18)再隨機(jī)分成糖尿病組(n=9)和治療組(n=9)。治療組動(dòng)物給安體舒通(20mg/kg),每日清晨灌胃,共 8周。其余兩組動(dòng)物灌以生理鹽水作對(duì)照。

2.2 檢測(cè)指標(biāo)及方法

2.2.1 生化指標(biāo)的檢測(cè):尿白蛋白(Albumin,ALB)檢測(cè)采用競(jìng)爭(zhēng)放射免疫分析法(天津協(xié)和醫(yī)學(xué)公司);尿視黃醇結(jié)合蛋白(Retinol-binding protein,RBP)檢測(cè)采用 ELISA(上海德波生物技術(shù)有限公司);尿 MCP-1檢測(cè)用雙抗體夾心 ELISA法 (美國(guó)Bio Source公司);糖化血紅蛋白 Ale(Glycosylated hemoglobin,HbAle)采用微柱層析法檢測(cè)。血鉀采用國(guó)產(chǎn)迅達(dá) XD687電解質(zhì)分析儀。

2.2.2 組織病理學(xué)觀察:第 8周留處死大鼠取腎臟組織,左腎用于計(jì)算腎臟肥大指數(shù)。取右腎部分腎組織置于液氮中保存用于做逆轉(zhuǎn)錄 PCR,其余用來觀察腎臟病理改變。計(jì)算腎小球基底膜足突融合率。

2.2.3 腎組織中 mcp-1的 RT-PCR檢測(cè):嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄 PCR的操作。以 MCP-1條帶與 GAPDH條帶光密度比值表示 MCP-1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量;采用 CT值法對(duì)基因表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行相對(duì)定量。

結(jié) 果

1 各組大鼠血糖及 HbAlc水平比較 見表 1。第8周,D、S組血糖均顯著高于 C組 (P＜0.01),D、S兩組間無顯著性差異(P＞ 0.05)。第 8周,D、S組 HbAlc均顯著高于 C組(P＜0.01),D組和 R組兩組間無顯著性差異(P＞ 0.05)。

表1 各組大鼠血糖及 HbAlc水平比較(±s)

表1 各組大鼠血糖及 HbAlc水平比較(±s)

注:與正常對(duì)照組相比,△P＜0.01

組 別 n 血糖(mmol/L)HbAlc(%)血鉀(mmol/L)C組 8 4.74± 0.98 5.63± 0.13 5.49± 0.20 D組 7 10.92± 3.13△ 12.40± 0.53△ 5.28± 0.23 S組 8 9.48± 1.58△ 11.63± 1.81△ 5.80± 0.26

2 各組尿生化結(jié)果及腎臟肥大指數(shù)比較 見表2。 第 8周時(shí),與 C組相比,D組和 S組大鼠尿 ALB、RBP、MCP-1排泄率均顯著升高(P＜0.01);與 D組相比,經(jīng)安體舒通治療后,S組上述各項(xiàng)指標(biāo)均明顯下降(P＜0.01)。腎臟肥大指數(shù):D組和 S組較 C組明顯增加(P＜0.01);與 D組比較,S組腎臟肥大指數(shù)明顯降低(P ＜0.01)。

3 電鏡結(jié)果 見附圖。 C組結(jié)構(gòu)清晰,基底膜均勻一致,無足突細(xì)胞融合。D組腎小球毛細(xì)血管基底膜厚薄不均,總體呈明顯增厚,結(jié)構(gòu)模糊不清,足突增粗、破壞、融合、消失,足突融合率高達(dá) 80%,系膜基質(zhì)增多、腫脹,系膜區(qū)擴(kuò)大,系膜細(xì)胞腫脹。 S組基底膜均勻一致,無明顯增厚,有少量足突細(xì)胞融合,足突融合率為20%。

表2 各組尿生化結(jié)果及腎臟肥大指數(shù)比較

附圖 3組大鼠腎臟電鏡觀察結(jié)果 (鈾鉛染色×15 000)

4 腎組織 mcp-1 m RNA的表達(dá) 見表 3。D組腎組織 mcp-1 mRNA的表達(dá)顯著高于 C組(P＜0.01),S組亦明顯高于 C組(P＜0.05);與 D組比較,S組腎組織 mcp-1 mRNA的表達(dá)明顯降低(P＜0.05)。

表3 各組大鼠 MCP-1基因表達(dá)半定量結(jié)果

5 相關(guān)性分析 UMCP-1排泄率與 UAER(r=0.800,P＜0.01)、URBP排泄率(r=0.911,P＜0.01)、腎臟肥大指數(shù)(r=0.771,P＜0.01)呈正相關(guān)。

討 論

醛固酮是鹽皮質(zhì)激素,主要在腎集合小管通過保鈉排鉀調(diào)節(jié)電解質(zhì)平衡和細(xì)胞外液容量。近年來臨床研究和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示醛固酮在糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用,抑制醛固酮系統(tǒng)對(duì)糖尿病腎損害有明顯治療作用[1～3]。在我們的實(shí)驗(yàn)中觀察到,與糖尿病組相比,安體舒通治療組明顯降低 24h尿蛋白及尿視黃醇結(jié)合蛋白的排泄,抑制腎小球肥大。電鏡觀察病理結(jié)果顯示病理形態(tài)的腎小球細(xì)胞外基質(zhì)明顯減少。上述結(jié)果提示對(duì)糖尿病腎損害存在一定程度的保護(hù)作用。這些結(jié)果與先前的研究報(bào)道[4],在肥胖大鼠和 db/db小鼠的 2型糖尿病模型中用醛固酮受體阻滯劑(MR)對(duì)其進(jìn)行干預(yù)治療所致的減少蛋白尿,膠原沉積以及腎小球肥大方面的作用是一致的。實(shí)驗(yàn)中還觀察到,與糖尿病組相比安體舒通組大鼠血糖無明顯變化,提示其具有獨(dú)立于降糖作用以外的腎臟保護(hù)作用。

炎性機(jī)制在糖尿病腎病的發(fā)病中起著重要作用。在早期糖尿病腎病患者,尿 mcp-1以及急性期炎癥標(biāo)志物表達(dá)增加[5]。近年來研究認(rèn)為 MCP-1通過單核巨噬細(xì)胞介導(dǎo)腎小管間質(zhì)炎癥、腎小管萎縮和間質(zhì)纖維化,加重 DN的進(jìn)展[6]。單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)是 CC趨化因子家族中的一員,它的主要功能是趨化和激活單核細(xì)胞至炎癥部位。在 DN中,單核 /巨噬細(xì)胞可以通過釋放蛋白水解酶和氧活性物質(zhì)導(dǎo)致腎小球結(jié)構(gòu)損傷,并可釋放改變腎小球功能的細(xì)胞因子而致腎小球結(jié)構(gòu)重塑。

中醫(yī)中藥對(duì)糖尿病腎病有一定治療作用[7～11],本組實(shí)驗(yàn)再次證實(shí):安體舒通治療組 mcp-1mRNA的表達(dá)明顯低于糖尿病組。尿 MCP-1排泄率與尿白蛋白和視黃醇結(jié)合蛋白排泄率以及腎臟肥大指數(shù)呈正相關(guān)。提示:炎癥因子 MCP-1參與糖尿病腎損害的發(fā)生,安體舒通能夠抑制 mcp-1的表達(dá),通過減輕炎癥反應(yīng)保護(hù)腎臟。

安體舒通保護(hù)糖尿病大鼠腎損害,減少尿和腎組織 mcp-1的表達(dá),其機(jī)制可能與安體舒通抑制醛固酮所致的活化 NF-к B,上調(diào) mcp-1的表達(dá)有關(guān)。 Sun等[12]報(bào)道在血管組織醛固酮所致的 mcp-1表達(dá)增加是通過 NF-к B介導(dǎo)的。醛固酮誘導(dǎo)的 NF-к B轉(zhuǎn)錄活性的增高,安體舒通可以抑制其所致的轉(zhuǎn)錄活性。以 NF-к B抑制劑治療亦可以消除 mcp-1的過度表達(dá)。 Han等[13]通過對(duì) 2型糖尿病大鼠模型分別予以醛固酮治療和醛固酮治療后安體舒通治療,結(jié)果證明醛固酮增加mcp-1的合成,與腎小球系膜細(xì)胞和血漿凝血致活酶成分中 NF-к B的活化有關(guān)。安體舒通治療可以減少醛固酮活化 NF-к B介導(dǎo)的 mcp-1的合成增加,通過減少腎臟的炎癥過程減輕腎小球硬化。

另外,安體舒通作為一種醛固酮拮抗劑有潛在的導(dǎo)致高鉀血癥的可能。在本組實(shí)驗(yàn)中,各組間血鉀水平?jīng)]有明顯的差別,可能與我們的干預(yù)治療時(shí)間不夠長(zhǎng)有關(guān)。

綜上所述,安體舒通主要通過抑制醛固酮所致NF-к B活化,下調(diào)糖尿病大鼠腎小球中 mcp-1的表達(dá)。減少尿白蛋白排泄及其炎癥反應(yīng),減少膠原沉積,抑制腎臟纖維化,顯示出獨(dú)立于降糖作用以外的腎臟保護(hù)作用。因此,在保護(hù) ST Z誘導(dǎo)的 2型糖尿病大鼠腎損害方面,安體舒通治療是一種較有效的方法。

[1]Eddy AA.Plasminogen activator inhibitor-1 and the kidney.Am J Physiol Renal Physiol,2002,283:209-220.

[2]Vassalli JD,Sappino AP,Belin D.The plasminogen activator/plasmin system.J Clin Invest,1991,88:1067-1072.

[3]Nicholas SB,Aguiniga E,Ren Y,et al.Plasminogen activator inhibitor-1 deficiency retards diabetic nephropathy.Kidney Int,2005,67:1297-1307.

[4]GuoC,Martinez-Vasquez D,Mendez GP,et al.Mineralocorticoid receptorantagonistreduces renal injury in rodent models oftypes 1 and 2 diabetes mellitus.Endocrinology,2006,147:5363-5373.

[5]Dalla-Vestra M,M ussap M,Gallina P,et al.Acutephase markers of inflammation and glomerular structure in patients with type 2 diabetes.J Am Soc Nephrol,2005,16(Suppl1):78-82.

[6]Kivici S,Erturk E,Budak F,et al.Serum monocyte chemoattractant protein-1 and monocyte adhesion molecules in type 1 diabetic patients with nephropathy.Arch Med Res,2006,37(8):998-1003.

[7]黨玉蘭.益腎蠲毒湯治療Ⅳ期糖尿病腎病 52例.陜西中醫(yī),2006,27(8):916-917.

[8]謝永俠,張福蘭,蘇榮芝.二元糖腎煎治療 2型糖尿病腎病 30例.陜西中醫(yī),2006,27(8):921-923.

[9]焦 玲,侯愛萍.參芪地黃湯配合西藥治療糖尿病腎病 35例.陜西中醫(yī) ,2006,27(8):923-924.

[10]曾菁蓉.桃紅參芪飲配合西藥治療早期糖尿病腎病 48例.陜西中醫(yī) ,2009,30(4):408-409.

[11]孫嵐云.補(bǔ)腎活血通絡(luò)法配合西藥治療Ⅲ期糖尿病腎病25例.陜西中醫(yī),2009,30(8):972-973.

[12]Sun Y,ZhangJ,Lu L,et al.Aldosterone-induced inflammation in the rat heart:role of oxidative stress.Am J Pathol,2002,161(5):1773-1781.

[13]Han SY,Kim CH,Kim HS,et al.Spironolactone prevents diabetic nephropathy through an antiinflammatory mechanism in type 2 diabetic rats.J Am Soc Nephrol,2006,17(5):1362-1372.