王彥 錢(qián)德儉 尉真 陸峻泓 張文杰 崔磊 曹誼林

血管再生在骨創(chuàng)傷后組織修復(fù)中占有舉足輕重的地位。人的血管發(fā)生是一個(gè)非常復(fù)雜的細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程，包括：血管形成（Vasculogenesis），由未分化的胚胎干細(xì)胞分化為成血管細(xì)胞（Angioblast），再形成內(nèi)皮細(xì)胞，彼此連接組成血管；血管新生或芽殖（Angiogenesis），由已形成的微血管內(nèi)皮細(xì)胞沖破管壁的基質(zhì)，遷移、增殖和連接組成新的血管[1]。這兩種方式在胚胎發(fā)育過(guò)程中均有出現(xiàn)，且時(shí)間上往往交錯(cuò)進(jìn)行。而成體創(chuàng)傷后，組織修復(fù)中血管的發(fā)生主要是芽殖方式。近年來(lái)，組織工程技術(shù)的迅猛發(fā)展給骨創(chuàng)傷后組織修復(fù)的基礎(chǔ)研究和臨床治療提供了新的思路。

人胚胎干細(xì)胞（Embryonic stem cells，ES）具有向三個(gè)胚層分化的潛能，是研究人胚胎發(fā)育和細(xì)胞分化的理想模型。隨著人ES細(xì)胞系的建立，應(yīng)用人ES細(xì)胞研究?jī)?nèi)皮細(xì)胞發(fā)生和血管形成成為可能[2-7]。我們將來(lái)源于人囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的ES細(xì)胞，以含維甲酸（Retinoic acid，RA）的培養(yǎng)液經(jīng)懸浮培養(yǎng)，形成擬胚體（Embryonic body，EB），再將 EB 貼壁，換含TGF-β1的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，形成內(nèi)皮細(xì)胞。該方法為研究骨創(chuàng)傷修復(fù)中內(nèi)皮細(xì)胞和血管發(fā)生及其機(jī)制建立了一個(gè)良好的模型，且有望為臨床治療提供新的種子細(xì)胞。

1 材料和方法

1.1 材料

人ES細(xì)胞株 （上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院組織工程實(shí)驗(yàn)室），knock-out DMEM（Gibco公司，美國(guó)），KO Serum Replacer（Hyclone 公司，美國(guó)），Non-essential Amino Acids（Gibco 公司，美國(guó)），L-glutamine（Sigma 公司，美國(guó)），β-mercaptoethanol（Sigma 公司，美國(guó)），b-FGF（Sigma 公司，美國(guó)），維甲酸 （Sigma公司， 美國(guó)），TGF-β1 （R&D 公司，美國(guó)），絲裂霉素 C（Sigma 公司，美國(guó)），Oct-4 抗體(兔抗小鼠多抗，中科院上海生化細(xì)胞所)，SSEA-4抗體（兔抗小鼠多抗，中科院上海生化細(xì)胞所），兔抗人Ⅷ因子抗體 （Santcruz公司，美國(guó)），鼠抗CD34單抗（Santcruz公司，美國(guó)），昆明小鼠（山東大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室）。

1.2 方法

1.2.1 人 ES 細(xì)胞培養(yǎng)

培養(yǎng)液為knock-out DMEM，含20%knock-out serum replacer、1%non-essential amino acids、1 mM L-glutamine、0.1 mM β-mercaptoethanol、4 ng/mL bFGF。37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)；5～7 d后，以 1 mg/mL Ⅳ型膠原酶消化，常規(guī)傳代。

1.2.2 擬胚體培養(yǎng)及誘導(dǎo)

取生長(zhǎng)良好的人ES細(xì)胞，機(jī)械法分割成小塊，接種到預(yù)先鋪陳1%瓊脂的培養(yǎng)皿，培養(yǎng)液為knock-out DMEM，含 20%knock-out serum replacer、1%non-essential amino acids、1 mM L-glutamine、0.1 mM β-mercaptoethanol，加維甲酸，至終濃度為1×10-9mol/L ，37 ℃、5%CO2培養(yǎng) 3～5 d，收集生長(zhǎng)較好的擬胚體，均等地移植到預(yù)先用0.1%明膠鋪陳的培養(yǎng)皿中，每孔約3～4個(gè)擬胚體，加含3 ng/mL TGF-β1的無(wú)血清DMEM，每隔2天換液，繼續(xù)培養(yǎng)。對(duì)照組加不含TGF-β1的無(wú)血清DMEM。每天觀察照相，并做相關(guān)檢測(cè)。

1.2.3 免疫熒光檢測(cè)

抗體：兔抗人Ⅷ因子抗體，工作濃度1∶100；羊抗兔IgG-羅丹明，工作濃度1∶50。免疫熒光染色：待擬胚體周?chē)只錾掀雍蛨A形細(xì)胞及血管樣結(jié)構(gòu)時(shí)，用PBS漂洗3遍，4%多聚甲醛固定10 min，再次PBS漂洗，0.25%Triton處理10 min，滴加Ⅷ因子抗體，37℃溫育1 h，PBS洗 3次，加 IgG-羅丹明，37 ℃反應(yīng) 45 min，PBS 漂洗，甘油/PBS（1∶2）封固，熒光顯微鏡觀察，照相。

1.2.4 Dil-Ac-LDL 標(biāo)記檢測(cè)

以無(wú)血清DMEM稀釋Dil-Ac-LDL為10 μg/mL，加至已分化出血管樣結(jié)構(gòu)的擬胚體培養(yǎng)皿中，37℃孵育4 h，將其去除，無(wú)血清DMEM洗3遍，熒光顯微鏡觀察，照相。

1.2.5 掃描電鏡觀察

取誘導(dǎo)后分化出的上皮樣和圓形細(xì)胞及血管樣結(jié)構(gòu)，以2%戊二醛固定，PBS漂洗，1%鋨酸固定，PBS漂洗，梯度乙醇脫水，醋酸正戊酯置換，CO2臨界點(diǎn)干燥，離子噴射儀噴金，掃描電鏡觀察。

1.2.6 透射電鏡觀察

取誘導(dǎo)后分化出的上皮樣和圓形細(xì)胞及血管樣結(jié)構(gòu)，2%戊二醛固定24 h，收集標(biāo)本，1%鋨酸后固定1 h，梯度乙醇脫水，1∶1丙酮包埋液滲透，EPON包埋，常規(guī)超薄切片，透射電鏡（JEM-1200EX）觀察細(xì)胞與血管的超微結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果

2.1 人ES細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)

體外培養(yǎng)的人ES細(xì)胞在飼養(yǎng)層細(xì)胞上以巢狀方式生長(zhǎng)（圖1），細(xì)胞間界限清楚，細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，細(xì)胞核質(zhì)比例高。

圖1 人ES細(xì)胞克?。≒17）（相差顯微鏡，100×）

2.2 擬胚體培養(yǎng)及誘導(dǎo)

培養(yǎng)的第5天，培養(yǎng)皿中形成球形的擬胚體，透亮、邊緣光潔 （圖2）。將EB貼壁，用含3 ng/mL TGF-β1的無(wú)血清DMEM誘導(dǎo)，第2天，EB周?chē)霈F(xiàn)上皮樣和圓形細(xì)胞（圖3）；第3天，開(kāi)始出現(xiàn)由圓形細(xì)胞構(gòu)成的管狀結(jié)構(gòu)，且圓形細(xì)胞逐漸變?yōu)楸馄綘罴?xì)胞。管狀結(jié)構(gòu)自EB向周?chē)瘦椛錉钌L(zhǎng)，并漸連接成網(wǎng)狀，管道排列清楚（圖4）。誘導(dǎo)組約有95%可分化為這類(lèi)結(jié)構(gòu)，而對(duì)照組絕大多數(shù)EB周?chē)窗l(fā)現(xiàn)血管樣結(jié)構(gòu)產(chǎn)生。

圖2 人ES細(xì)胞懸浮培養(yǎng)形成擬胚體（相差顯微鏡，100×）

圖3 擬胚體貼壁第2天，圓形細(xì)胞出現(xiàn)（相差顯微鏡，100×）

圖4 擬胚體貼壁第3天，上皮樣細(xì)胞及血管樣結(jié)構(gòu)出現(xiàn)（相差顯微鏡，100×）

2.3 免疫熒光檢測(cè)

人ES細(xì)胞誘導(dǎo)分化的細(xì)胞，經(jīng)Ⅷ因子免疫熒光檢測(cè)呈陽(yáng)性（圖5），證明這類(lèi)細(xì)胞具有內(nèi)皮細(xì)胞性質(zhì)。

圖5 人ES細(xì)胞誘導(dǎo)分化的管狀結(jié)構(gòu)Ⅷ因子表達(dá)陽(yáng)性（40×）

2.4 Dil-Ac-LDL 標(biāo)記檢測(cè)

Dil-Ac-LDL攝取實(shí)驗(yàn)結(jié)果呈陽(yáng)性，表現(xiàn)為紅色熒光（圖6），證明hES細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化的細(xì)胞具有內(nèi)皮細(xì)胞的功能。

圖6 Dil-Ac-LDL攝取實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性

2.5 掃描電鏡觀察

管狀結(jié)構(gòu)的管壁最初由許多圓形細(xì)胞和扁平狀細(xì)胞組成，隨著管狀結(jié)構(gòu)的延伸，細(xì)胞逐漸減少，管壁變得光滑（圖7）。

圖7 掃描電鏡觀察

2.6 透射電鏡觀察

誘導(dǎo)出的血管樣結(jié)構(gòu)由幾個(gè)內(nèi)皮樣細(xì)胞圍成，細(xì)胞扁平，表面較光滑，相鄰的細(xì)胞間連接緊密，與正常毛細(xì)血管結(jié)構(gòu)非常相似（圖8）。

圖8 透射電鏡觀察

3 討論

血管形成是非常復(fù)雜的過(guò)程，主要涉及內(nèi)皮細(xì)胞的激活和增殖、微環(huán)境中的細(xì)胞基質(zhì)成分和結(jié)構(gòu)，以及它們之間的相互作用[8]。同時(shí)，這些過(guò)程又和各種細(xì)胞因子的產(chǎn)生及協(xié)同作用是分不開(kāi)的[9－10]。已有證據(jù)表明，TGF-β1是血管形成的刺激因子，在創(chuàng)傷愈合過(guò)程中，可能是通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞基質(zhì)合成，從而影響內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)行為，使其形成管狀結(jié)構(gòu)[11－12]。另有研究認(rèn)為，內(nèi)皮細(xì)胞的增殖刺激或抑制效應(yīng)依賴于 TGF-β1的濃度，0.02～0.1 ng/mL 的 TGF-β1 對(duì)胎牛心臟內(nèi)皮細(xì)胞顯示生長(zhǎng)刺激作用，而高濃度（0.5～10 ng/mL）的 TGF-β1 則顯示生長(zhǎng)抑制作用[13]，表明TGF-β1對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)和血管結(jié)構(gòu)形成有著密切關(guān)系。

ES細(xì)胞不同的生長(zhǎng)方式和所受RA濃度對(duì)其分化細(xì)胞類(lèi)型有重大影響[14]。低濃度RA（1×10-9mol/L）和TGF-β1協(xié)同作用，易使ES細(xì)胞誘導(dǎo)形成中胚層性質(zhì)的分化細(xì)胞[15]。本實(shí)驗(yàn)用懸浮培養(yǎng)法結(jié)合低濃度RA處理5 d，使人ES細(xì)胞形成EB，然后移至明膠包被的培養(yǎng)皿中，以含TGF-β1的培養(yǎng)液使其貼壁生長(zhǎng)，數(shù)天后EB周?chē)霈F(xiàn)大量圓形細(xì)胞，同時(shí)形成許多自EB向周?chē)椛涞难軜咏Y(jié)構(gòu)，該現(xiàn)象重復(fù)性高，表明低濃度RA和TGF-β1協(xié)同作用，對(duì)人ES分化并形成管樣結(jié)構(gòu)有重要作用。

vWF是一種存在于血漿中的大分子糖蛋白，是凝血因子Ⅷ的載體，主要由內(nèi)皮細(xì)胞合成，可使血小板黏附并聚集在受損的血管壁。vWF被認(rèn)為是內(nèi)皮細(xì)胞的特異性標(biāo)記[16]。DiI是一種親脂性碳花青染料，容易嵌進(jìn)生物質(zhì)膜內(nèi)，并在膜內(nèi)做定向擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)，從而標(biāo)記整個(gè)細(xì)胞。熒光染料DiI標(biāo)記的低密度脂蛋白 （Low density lipoprotein，LDL）， 即 Dil-LDL被廣泛應(yīng)用于內(nèi)皮細(xì)胞的鑒定[2，17－18]。本實(shí)驗(yàn)中，vWF免疫熒光染色和Dil-LDL直接熒光檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性，表明構(gòu)成管樣結(jié)構(gòu)的細(xì)胞具有內(nèi)皮細(xì)胞性質(zhì)。證明低濃度RA和TGF-β1可誘導(dǎo)人ES細(xì)胞分化為內(nèi)皮細(xì)胞及血管樣結(jié)構(gòu)。

相差顯微鏡和掃描電鏡觀察證實(shí)，人ES細(xì)胞所分化的管狀結(jié)構(gòu)的管壁，最初由許多圓形細(xì)胞或扁平狀細(xì)胞組成，隨著管狀結(jié)構(gòu)的延伸，管壁變得光滑。該結(jié)果提示，本誘導(dǎo)體系作用于人ES細(xì)胞，可在體外模擬血管形成的演變過(guò)程。

透射電鏡結(jié)果顯示，誘導(dǎo)的血管樣結(jié)構(gòu)由扁平細(xì)胞圍成，細(xì)胞表面較光滑，相鄰細(xì)胞間有緊密連接，與正常的人毛細(xì)血管非常相似。

本實(shí)驗(yàn)提供了一個(gè)研究?jī)?nèi)皮細(xì)胞發(fā)生和血管形成的模型。但是，RA與TGF-β1的作用機(jī)制，以及ES細(xì)胞向血管演變中參與的因素等問(wèn)題尚需進(jìn)一步研究。另外，作為內(nèi)皮細(xì)胞的來(lái)源之一，ES細(xì)胞分化為內(nèi)皮細(xì)胞的研究還面臨很多問(wèn)題，如分化細(xì)胞的純化，傳代與大量擴(kuò)增以及保存等，這些問(wèn)題的解決，將能使ES細(xì)胞成為較好的種子細(xì)胞來(lái)源。

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