人誘導多能干細胞在再生醫(yī)學和疾病建模領(lǐng)域，都具有巨大的應用價值。與胚胎干細胞不同的是，它們可在保留原宿主遺傳信息的情況下進行多向分化，而且不引發(fā)倫理問題。目前，擬胚體形成法是人誘導多能干細胞分化為成體細胞的主要方法之一，該方法模擬了早期胚胎發(fā)育的生理過程。

大血管病變是糖尿病的主要并發(fā)癥之一，當腦部血管硬化時，可能會影響腦血流動力學，使中樞神經(jīng)系統(tǒng)長期處于慢性缺血缺氧狀態(tài)，對認知水平產(chǎn)生影響；微血管病變是糖尿病另一主要并發(fā)癥，其病理改變包括微循環(huán)障礙、微血管形成和基底膜增厚，手術(shù)和麻醉的應激可能會加重這一病理改變，繼而加重認知損傷。

在體外懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)中，人誘導多能干細胞因細胞間重力和張力作用自發(fā)形成的細胞聚集體即為擬胚體，具有向三胚層分化的潛力。擬胚體分化過程需要相對較長的培養(yǎng)時間，細胞外部培養(yǎng)環(huán)境可對細胞分化、形態(tài)和增殖等生物學行為產(chǎn)生深遠的影響。目前，人誘導多能干細胞主要采用21%氧氣條件進行擬胚體分化，但在正常的人體生理狀態(tài)下，干細胞主要生存于低氧環(huán)境，氧氣濃度范圍在1%～9%。因此有必要深入了解低氧環(huán)境是否有助于干細胞向擬胚體分化。目前低氧環(huán)境對不同來源干細胞形成擬胚體過程的影響結(jié)論不一，有研究顯示人胚胎干細胞形成擬胚體過程中，低氧環(huán)境可以促進細胞的分化過程，但是會增加了細胞凋亡而減緩擬胚體生長速度；但也有不同的研究結(jié)果顯示，低氧環(huán)境能促進人胚胎干細胞或鼠誘導多能干細胞更高效地向擬胚體分化；還有研究使用牛誘導多能干細胞形成擬胚體，發(fā)現(xiàn)擬胚體的形成并不受到低氧環(huán)境的影響。在低氧條件下，細胞主要受HIF-1α和其他相關(guān)信號通路的調(diào)節(jié)，例如Wnt/β-catenin和VEGFA信號通路，均可參與調(diào)節(jié)細胞的增殖、分化和存活。關(guān)于低氧環(huán)境是否有利于人誘導多能干細胞通過擬胚體法進行分化，以及不同時間點上產(chǎn)生何種影響等問題，目前均未有明確結(jié)論。

本研究擬采用人誘導多能干細胞作為研究對象，通過設(shè)計正常氧氣濃度及低氧兩種不同環(huán)境，結(jié)合分化過程的時間軸獲得不同階段變化結(jié)果，對分化過程中擬胚體的形成、成熟、粘附、擴增和三胚層分化潛力的功能特性進行分析判斷，并且進一步檢測低氧信號通路相關(guān)分子的表達情況。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

mTeSR1 培養(yǎng)基、ReLeSR、Dispase、L-谷氨酰胺、1%非必需氨基酸、0.1%明膠（STEMCELL）；低生長因子-基質(zhì)膠、超低吸附六孔板（BD Corning）；高糖DMEM、胎牛血清FBS、PBS（Gibco）；β-巰基乙醇、多聚甲醛（Sigma）；HIF-1α特異性抑制劑Echinomycin、抗OCT4、SOX2、NANOG 抗 體（Abcam）；Image-iT ?Green缺氧檢測試劑、Alexa Fluor 488二抗、4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）、Trizol試劑（Invitrogen）；預混型定量用反轉(zhuǎn)錄試劑盒、TB Green染料法標準型定量試劑盒（寶日醫(yī)公司）；SDS-PAGE凝膠快速配制試劑盒、細胞總蛋白提取試劑盒、超敏ECL化學發(fā)光試劑盒（碧云天公司）；抗體HIF-1α、β-catenin、VEGFA、Tublin（Abcam）；THUNDER 3D細胞顯微鏡（Leica）；低氧培養(yǎng)箱、全波長酶標儀（Thermo Scientific）；熒光定量PCR 儀（qTOWER3G）；SDS-PAGE電泳儀（Bio-Rad）化學發(fā)光成像儀（ImageQuant LAS 500）。

市中心遠遠地朦朦朧朧地站著，行人很少，全街靜悄無聲。我們一家挨一家地問著，我比她更急切，我想趕快買到吧，我小心地盤問著那些店員們，我從來不放棄一個細微的機會，我鼓勵翠姨，沒有忘記一家。使她都有點兒詫異，我為什么忽然這樣熱心起來，但是我完全不管她的猜疑，我不顧一切地想在這小城里，找出一雙絨繩鞋來。

1.2 實驗分組

將第15～18代的人誘導多能干細胞接種于普通六孔板中，細胞生長至80%后用Dispase消化成細胞團塊，平均分到兩個超低吸附六孔板的孔中，分別在21%氧氣（懸浮常氧組）和5%氧氣（懸浮低氧組）條件下培養(yǎng)5 d，隨后取將懸浮低氧組的擬胚體平均分到兩個明膠包被的六孔板中，一組繼續(xù)在5%氧氣條件下培養(yǎng)2 d（貼壁低氧組），另一組先在5%氧氣條件下培養(yǎng)1 d后加入1 nmol/L Echinomycin（貼壁低氧組＋Echinomycin），繼續(xù)培養(yǎng)1 d；從常氧培養(yǎng)的懸浮擬胚體中取與貼壁低氧組等量的懸浮擬胚體，繼續(xù)在21%氧氣條件下培養(yǎng)2 d（貼壁常氧組），每組至少重復3次實驗。

1.3 人誘導多能干細胞的培養(yǎng)

將Cellapy公司購買的人誘導多能干細胞接種于表面涂有低生長因子-基質(zhì)膠的培養(yǎng)皿上，并在21%氧氣條件下用mTeSR1培養(yǎng)基培養(yǎng)，每天更換培養(yǎng)基，每4天使用ReLeSR 將細胞以團塊形式消化傳代。

通過RT-PCR檢測人誘導多能干細胞、21%和5%氧氣條件下擬胚體的三胚層標記基因表達情況，實驗結(jié)果提示人誘導多能干細胞形成擬胚體后各胚層的基因表達均上調(diào)，包括內(nèi)胚層標記基因AFP、FOXA2和GATA6（圖4A），中胚層標記基因ACTA、LPL 和SPP（圖4B），外胚層標記基因PAX6、VIMENTIN 和NESTIN（圖4C）。

1.4 懸浮期和貼壁期擬胚體的低氧檢測

分別在21%和5%氧氣條件下，取適量懸浮期第5天以及貼壁期第2天的擬胚體到玻璃培養(yǎng)皿，將ImageiT?Green缺氧檢測試劑加入到細胞培養(yǎng)基，使其濃度達到5μmol/L，接著繼續(xù)在原條件下孵育1 h，用DAPI進行核染色，最后在熒光顯微鏡下觀察細胞的熒光表達強度。

1.5 人誘導多能干細胞分化形成懸浮擬胚體

當人誘導多能干細胞生長達到培養(yǎng)皿的80%時，利用Dispase消化7 min后機械刮取細胞，確保初始細胞團塊大小相似，排除初始細胞密度和大小對后續(xù)擬胚體發(fā)育的影響，隨后均勻分到兩個超低吸附六孔板中，分別21%和5%氧氣條件下，在mTeSR1培養(yǎng)基中形成懸浮擬胚體，在整個分化過程中，氧氣濃度始終保持不變。擬胚體懸浮階段，mTeSR1培養(yǎng)基逐漸轉(zhuǎn)為擬胚體培養(yǎng)基（高糖DMEM、10%FBS、2 mmol/L L-谷氨酰胺、1%非必需氨基酸、0.012 mmol/L β-巰基乙醇），懸浮期mTeSR1培養(yǎng)基和擬胚體培養(yǎng)基配比為：第1天2∶1，第2天1∶1，第3天1∶2，第4天和第5天100%擬胚體培養(yǎng)基。

1.6 擬胚體的貼壁培養(yǎng)

本實驗觀察到人誘導多能干細胞是以集落樣生長方式為主，邊界清晰，集落形態(tài)呈圓形、橢圓形或不規(guī)則形，集落中的細胞緊密地聚集在一起，且細胞核質(zhì)比高。人誘導多能干細胞具有多能性，通過免疫熒光法檢測相關(guān)干性標志物，發(fā)現(xiàn)集落內(nèi)的細胞均發(fā)出紅色熒光，強烈表達OCT4、SOX2、NANOG（圖1）。

1.7 細胞免疫熒光

用作品來說話，是一個歌手最直接的表達；作品能否長久地被接受，是對歌手最真實的考驗。說唱對艾熱來說，是青春期想要表達自我、抒發(fā)感情或者發(fā)泄情緒時遇見的一種音樂類型，它不僅僅教會了艾熱用另一種方式說話，也帶給了他成就感。

3.4 個體化系統(tǒng)管理模式提高母乳喂養(yǎng)率 觀察組產(chǎn)婦在產(chǎn)后半小時給予早接觸、早吸吮，產(chǎn)后4 h給予乳房按摩催乳，及母乳喂養(yǎng)的指導，結(jié)果顯示，觀察組產(chǎn)婦泌乳始動時間明顯早于對照組，差異有統(tǒng)計學意義。產(chǎn)后24 h體內(nèi)血清PRL水平明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義。從而為泌乳奠定了基礎(chǔ)，保證了圍產(chǎn)期的泌乳量，提高了母乳喂養(yǎng)率[13]。本文觀察組產(chǎn)后42 d純母乳喂養(yǎng)率明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義。

1.8 RT-PCR檢測相關(guān)基因的表達

使用Trizol 試劑抽提人誘導多能干細胞、21%和5%氧氣條件下懸浮期第5天擬胚體以及貼壁期第2天各組擬胚體的總RNA，每個樣本取1 μg RNA，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒的使用說明書進行cDNA反轉(zhuǎn)錄。以cDNA為模板，引物序列見表1，分別擴增內(nèi)胚層相關(guān)基因（AFP,FOXA2,GATA6）、中胚層相關(guān)基因（ACTA,LPL,SPP）和外胚層相關(guān)基因（PAX6,VIMENTIN,NESTIN），低氧相關(guān)信號通路（HIF-1α、β-catenin、VEGFA），以β-actin作為內(nèi)參基因。兩步法PCR擴增的標準程序為：預變性95 ℃30 s，1個循環(huán)；PCR反應：95 ℃5 s，60 ℃30 s，40 個循環(huán)；熔解：95 ℃15 s，60 ℃1 min。

1.9 Western blot檢測HIF-1α、β-catenin和VEGFA蛋白表達情況

擬胚體貼壁2 d后，利用RT-PCR檢測21%和5%氧氣條件下HIF-1α、β-catenin、VEGFA基因的表達情況，可見不同氧氣條件下HIF-1α的mRNA水平?jīng)]有明顯差異（＞0.05），而低氧條件下β-catenin和VEGFA基因的表達上調(diào)，差異具有統(tǒng)計學意義（圖6A，＜0.05）。接著，利用Western blot 檢測2 種氧氣條件下HIF-1α、βcatenin和VEGFA蛋白的表達情況，實驗結(jié)果顯示，與21%氧氣條件組相比，低氧條件可上調(diào)HIF-1α、βcatenin 和VEGFA 蛋白的表達，差異具有統(tǒng)計學意義（圖6B、C，＜0.05）。

1.10 統(tǒng)計學方法

擬胚體貼壁1 d后，會有部分擬胚體無法粘附到培養(yǎng)皿上，常氧和低氧組的擬胚體粘附率分別為71.67%和81.67%，差異有統(tǒng)計學意義（圖5A、B，＜0.05）。擬胚體粘附后，開始有不規(guī)則的多邊形細胞從擬胚體邊緣爬出，計算粘附第2天與第1天擬胚體邊緣生長出細胞的直徑比值，在常氧和低氧條件下直徑分別增加了2.75倍和6.39倍，差異具有統(tǒng)計學意義（圖5C、D，＜0.05）。

2 結(jié)果

2.1 人誘導多能干細胞的鑒定

將等量21%和5%氧氣條件下培養(yǎng)了5 d的擬胚體接種到涂有0.1%明膠的培養(yǎng)皿上，加入2 mL擬胚體培養(yǎng)基培養(yǎng)，1 d后吸走未貼壁的擬胚體，計算擬胚體貼壁率；繼續(xù)在21%和5%氧氣條件下培養(yǎng)1 d，顯微鏡下觀察從擬胚體4周爬出的細胞，通過與第1天貼壁時的擬胚體直徑相比，評估擬胚體貼壁后的增殖速率。

2.2 擬胚體懸浮期和貼壁期低氧環(huán)境的檢測

利用Image-iT?Green缺氧檢測試劑檢測細胞低氧情況，與21%氧氣條件下培養(yǎng)的細胞相比，實驗發(fā)現(xiàn)當細胞置于5%氧氣條件時綠色熒光強度明顯增強（圖2）。

2.3 低氧環(huán)境能夠促進懸浮擬胚體的形成和成熟

利用顯微鏡觀察人誘導多能干細胞形成擬胚體過程的形態(tài)變化，在常氧和低氧條件下，懸浮培養(yǎng)1 d后的擬胚體直徑大約在100 μm，結(jié)構(gòu)均較為簡單，主要由緊密排列的人誘導多能干細胞組成。懸浮培養(yǎng)的第3天，低氧組出現(xiàn)內(nèi)部顏色較深的擬胚體即為囊性擬胚體，是擬胚體成熟的重要標志，而在常氧組，懸浮期第4天才可觀察到少量囊性擬胚體。懸浮培養(yǎng)5 d后，幾乎所有低氧條件下的擬胚體發(fā)生囊腔化，邊緣光滑整齊，大小顏色相對一致，而在常氧條件下可觀察到大小不同的擬胚體，且未完全呈現(xiàn)囊腔化。在5天的懸浮期里，隨著擬胚體內(nèi)部細胞的不斷生長，常氧組和低氧組的平均擬胚體直徑逐漸增長到200 μm左右，二者無明顯差異。此外還可以觀察到懸浮期內(nèi)常氧組的擬胚體周圍每天都會有較多的細胞碎片，大多是凋亡的人誘導多能干細胞，而低氧條件下，細胞碎片明顯減少（圖3），低氧可促進懸浮期內(nèi)擬胚體的形成和后續(xù)的成熟。

2.4 21%和5%氧氣條件下形成的擬胚體均具有向三胚層分化的潛力

長垣縣位于河南省東北部，土質(zhì)肥沃，農(nóng)用價值高，種植作物以小麥、玉米、花生等為主。近年來，為順應市場發(fā)展要求，實現(xiàn)農(nóng)民增收、農(nóng)業(yè)增效的目的，長垣縣堅持以綠色理念引領(lǐng)農(nóng)業(yè)發(fā)展，大力調(diào)整農(nóng)業(yè)結(jié)構(gòu)，積極推動現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展區(qū)域布局規(guī)劃，完善涉農(nóng)優(yōu)惠扶持政策，大力發(fā)展現(xiàn)代高效農(nóng)業(yè)，持續(xù)提高農(nóng)業(yè)板塊比較效益。

2.5 低氧環(huán)境有利于提升擬胚體貼壁率以及貼壁后細胞從擬胚體邊緣向外生長

本研究采用軟件SPSS 27.0進行統(tǒng)計學分析，采用均數(shù)±標準差表示計量資料，兩組獨立樣本采用檢驗進行組間比較，多組樣本間比較采用單因素方差分析，＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2.6 21%和5%氧氣條件下貼壁擬胚體HIF-1α、βcatenin、VEGFA的表達

收集貼壁2 d的擬胚體，預冷PBS洗滌3次后加入細胞蛋白裂解液，冰上裂解30 min，提取樣本總蛋白，BCA法檢測各組樣本蛋白濃度，按每孔20 μg蛋白進行凝膠電泳，然后轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上，室溫封閉1 h，TBST洗膜3次，隨后加入相應一抗，4 ℃條件下孵育過夜。第2天回收一抗，TBST洗膜3次后加入相應二抗4 ℃孵育2 h，再次洗膜3次后，利用增強型化學發(fā)光試劑（ECL）檢測顯影，使用ImageJ軟件進行灰度值定量分析，以Tublin作為內(nèi)部參考。

將人誘導多能干細胞接種在裝有玻璃載玻片的六孔板中，當細胞生長到30%時，用PBS 輕輕洗滌3 次，室溫條件下用4%多聚甲醛固定30 min，然后用含有10% FBS的PBST（含有0.3%Triton X-100的PBS）通透封閉45 min，接著細胞與待測的一抗在4 ℃下孵育過夜。一抗孵育后PBS 洗3 次，常溫下再與相應的二抗孵育1 h，PBS漂洗，隨后對細胞核進行DAPI染色。最后用熒光顯微鏡觀察染色細胞，并使用Image J軟件完成圖像處理和分析。

2.7 5%氧氣條件下HIF1α抑制劑Echinomycin對貼壁擬胚體的β-catenin和VEGFA表達的影響

Echinomycin 是HIF-1α的特異性抑制劑，使用1 nM的Echinomycin處理5%氧氣條件下的貼壁擬胚體1 d后，利用Western blot可檢測到HIF-1α明顯下調(diào)，βcatenin和VEGFA也顯著下調(diào)（圖7A、B，＜0.05）。

3.1 科學規(guī)劃 適地適栽，避免在冬季氣溫過低（美味獼猴桃一般極端最低溫度不低于-15℃，中華獼猴桃不低于-10℃）的地方建園；避免在盆地、低洼地或河灘地、空氣不流暢的地方建園；選擇土層深厚、土壤肥沃的園地建園。同時，盡量選擇抗寒性強的砧木和品種。

3 討論

氧氣是胚胎發(fā)育的一種基本生理條件，其早期階段是在一個相對低氧的環(huán)境中進行的，可能是因為早期循環(huán)系統(tǒng)沒有完全建立，血液氧氣擴散受到限制，也可能是胚胎時期的細胞處于快速增殖期，氧氣消耗量大。據(jù)文獻報道，低氧濃度可顯著促進胚胎發(fā)育至囊胚期，從而提高胚胎質(zhì)量。由此推斷，生理低氧濃度應該會對人誘導多能干細胞向擬胚體分化過程產(chǎn)生影響。本研究的實驗結(jié)果明確證實這一推斷，發(fā)現(xiàn)低氧環(huán)境有利于生成大量貼壁性能高、增殖速度快且大小分布較均勻的擬胚體，且低氧條件不影響擬胚體三胚層分化潛力。

有學者提出在干細胞向擬胚體分化的過程中，細胞內(nèi)線粒體的代謝副產(chǎn)物活性氧會急劇增加，活性氧對細胞毒性很大，會導致細胞凋亡。推測低氧可以抑制線粒體功能，減少有害的活性氧的過度產(chǎn)生，降低細胞凋亡，從而加強懸浮擬胚體中細胞間的相互聯(lián)系。本研究結(jié)果也顯示低氧環(huán)境促進人誘導多能干細胞形成大小較均勻的、成熟比例增多的擬胚體，證明低氧環(huán)境對均勻成熟擬胚體的形成以及進一步穩(wěn)定分化的可行性和重要性。

農(nóng)場雖然耕地面積較大但大型谷物聯(lián)合收割機和配套農(nóng)具數(shù)量多遠多于地方，部分合作社和農(nóng)戶要等到農(nóng)場收獲完成后租賃農(nóng)場機械進行收獲作業(yè)，錯過了最佳收獲時期無法保證顆粒歸倉。

我們發(fā)現(xiàn)，低氧組獲得的懸浮擬胚體與培養(yǎng)皿的粘附性較常氧組強，且相同時間內(nèi)向外擴增的距離更大，提示低氧可以促進擬胚體的粘附和增殖性能。這可能與分化的成熟擬胚體較多，細胞分泌的促粘附細胞因子增多有密切關(guān)系。此外，低氧還可促進干細胞分化過程中細胞的增殖能力，其機制可能與HIF-1α及其下游等相關(guān)信號通路被激活有關(guān)。本研究還發(fā)現(xiàn)，HIF-1α主要在蛋白質(zhì)水平而不是在mRNA水平上發(fā)揮作用，這與之前的研究結(jié)果一致。我們還發(fā)現(xiàn)，βcatenin和VEGFA的mRNA和蛋白質(zhì)水平均可在低氧條件下上調(diào)，這些分子均可受HIF-1α激活調(diào)控，參與多種細胞生物學行為，包括細胞存活、粘附和擴增。因此，有理由認為，適當?shù)牡脱醺玫啬M了擬胚體發(fā)育的微環(huán)境，為細胞擴增提供了更合適的生存條件。當然，為了獲取足夠數(shù)量的細胞，研究者們還嘗試通過改善細胞外基質(zhì)、施加力學刺激和優(yōu)化培養(yǎng)基質(zhì)等方法來改善細胞粘附性能，提高后續(xù)細胞增殖速度。

綜上所述，低氧環(huán)境的設(shè)計可以明顯促進人誘導多能干細胞分化為擬胚體的過程，且目前很多干細胞分化方案都是基于擬胚體分化體系建立的，可通過調(diào)節(jié)氧氣濃度或者HIF-1α/β-catenin/VEGFA通路控制擬胚體的分化方向，從而提高干細胞的分化效率，這將為進一步推動其應用研究提供實驗證據(jù)。