張 蕾，王宵燕，左其生，路鎮(zhèn)宇，王 飛，紀艷芹，王穎潔，張亞妮*，李碧春*

(1.揚州大學動物科學與技術學院 江蘇省動物遺傳繁育與分子設計重點實驗室，揚州 225009； 2.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學院，泰州 225300)

懸滴培養(yǎng)法促進雞胚胎干細胞形成類胚體

張 蕾1，2，王宵燕1，左其生1，路鎮(zhèn)宇1，王 飛1，紀艷芹1，王穎潔1，張亞妮1*，李碧春1*

(1.揚州大學動物科學與技術學院 江蘇省動物遺傳繁育與分子設計重點實驗室，揚州 225009； 2.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學院，泰州 225300)

本研究旨在通過懸浮培養(yǎng)法培養(yǎng)雞胚胎干細胞(Embryonic stem cells，ESCs)，摸索雞胚胎干細胞形成類胚體(Embryoid body，EB)的最佳方案，以期提高雞胚胎干細胞體外誘導效率。 將雞ESCs培養(yǎng)傳代至第3代，采用1×104、3×104和6×104mL-13個細胞濃度，使用懸滴培養(yǎng)后，觀察類胚體的形成效率。對懸滴培養(yǎng)形成的類胚體進行形態(tài)學觀察，qRT-PCR檢測干細胞標記基因的表達，免疫細胞化學檢測相關蛋白的表達，并進行類胚體自分化檢測和核型分析。3×104mL-1細胞濃度生成的類胚體數(shù)量最高，單個視野下可觀察到約267個類胚體，且形成的類胚體大小均一，呈圓球狀。qRT-PCR檢測結果表明，在類胚體形成48 h內(nèi)，干細胞標記基因Nanog、Sox2、Oct4和C-kit仍維持表達。免疫細胞化學檢測顯示，該方法形成的類胚體表面抗原檢測Nanog和SSEA-1呈陽性。自分化檢測三胚層分化標記基因SOX17、SMA和TUJ-1呈陽性。核型分析顯示，懸滴培養(yǎng)形成的類胚體具有并保持正常的核型。雞ESCs懸滴培養(yǎng)形成類胚體的適宜細胞濃度為3×104mL-1，且形成的類胚體可分化成3個胚層，用于體外定向誘導過程。本研究建立了雞ESCs體外懸滴培養(yǎng)形成類胚體的培養(yǎng)體系，為后期信號通路的體外驗證提供試驗基礎。

類胚體；懸滴培養(yǎng)；雞；胚胎干細胞

胚胎干細胞(Embryonic stem cells，ESCs)具有多向分化的潛能，能夠分化成包括內(nèi)胚層、中胚層和外胚層3個胚層在內(nèi)的各種類型細胞，因此ESCs不僅僅可應用于早期胚胎發(fā)育的研究，還可作為細胞替代治療和藥物篩選等的細胞來源。胚胎干細胞的誘導分化是指在體外將胚胎干細胞定向誘導分化成具有功能的其他類型細胞，純化的ESCs在非細胞因子體外培養(yǎng)條件下(無白血病抑制因子等細胞分化抑制因子)可自發(fā)形成類胚體(Embryoid body，EB)[1-4]。EB由分化細胞和未分化細胞組成，在形成階段具有較強的分化潛能，故在EB早期形成階段常被用于生產(chǎn)不同細胞系[5]。EB還被廣泛用于特定組織細胞的誘導分化，有助于提高定向誘導的分化效率[6-7]。因此，EB的制備已經(jīng)成為干細胞研究不可或缺的工具[8-10]。

家禽是發(fā)育生物學中重要的動物模型，且從雞胚中可以獲得能夠滿足研究需要的雞ESCs，克服了取材和倫理上的限制。本課題組一直致力于家雞ESCs的體外定向誘導分化研究[11-13]，通過特定的誘導體系誘導雞ESCs形成雄性生殖細胞，然而誘導效率較低。本研究以家雞為研究對象，采用懸滴培養(yǎng)方法，用不同細胞濃度的ESCs形成類胚體，并通過形態(tài)學、qRT-PCR和免疫細胞化學檢測形成的類胚體中全能性基因的表達。摸索雞ESCs懸滴培養(yǎng)形成類胚體的最佳條件，通過類胚體進行體外誘導，從而進一步提高雞雄性生殖細胞的誘導效率。該研究為進一步優(yōu)化雞ESCs向生殖細胞定向分化提供理論和試驗基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

新鮮受精蛋來自中國農(nóng)業(yè)科學院家禽研究所實驗禽場如皋黃雞雞群。按H.Eyal-Giladi等[14]方法分為Ⅸ～Ⅺ期，采用產(chǎn)蛋后5 h以內(nèi)的雞蛋進行雞胚盤細胞的分離。

主要試劑：高糖DMEM(Gibco，美國)；胎牛血清(Hyclone，美國)；β-巰基乙醇(BBI，加拿大)； 胚胎階段特異抗原1(SSEA-1)、Sox2和IgG-FITC(Genetimes)(博奧森，北京)；雞血清、L-谷氨酰胺、堿性成纖維生長因子(bFGF)、人干細胞因子(hSCF)、鼠白血病抑制因子(mLIF)(Sigma，美國)。反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒(天根，北京)。

1.2 方法

1.2.1 雞ESCs的分離培養(yǎng)及鑒定 參照孫敏等[13]ESCs分離培養(yǎng)及傳代步驟進行。

1.2.2 懸滴培養(yǎng)雞ESCs 將雞ESCs培養(yǎng)傳代至第3代，待ESCs克隆開始形成，大小相差不大時，加入1 mg·mL-1Collage Ⅳ，37 ℃消化10 min，加入含5% FBS的DMEM終止消化，收集ESCs克隆并制成細胞懸液。將細胞懸液進行細胞計數(shù)，設立3個細胞濃度：1×104、3×104和6×104mL-1，每組3個重復。將10 cm的培養(yǎng)皿上蓋打開，內(nèi)表面朝上，25 μL細胞懸液，逐滴整齊地滴加在皿蓋上；在皿內(nèi)加上3 mL PBS后，小心將皿蓋扣至皿底上，再將培養(yǎng)皿放入培養(yǎng)箱中。采用倒置顯微鏡每隔24 h觀察各組細胞的形態(tài)變化情況。

1.2.3 qRT-PCR檢測 各組細胞懸滴培養(yǎng)后，分別提取0、24和48 h的細胞總RNA。每個時期均有3個重復。將獲取的總RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，以β-actin為內(nèi)參基因，進行qRT-PCR檢測。qRT-PCR所需引物信息見表1。

1.2.4 免疫細胞化學檢測 懸滴培養(yǎng)48 h后，用微量移液器將各組懸滴培養(yǎng)后形成的EB吸出，分別接種到多聚賴氨酸處理過的24孔板內(nèi)。待細胞貼壁后，用4%多聚甲醛固定30 min。PBS漂洗3次后，用10% BSA-PBS封閉液37 ℃孵育1 h。分別滴加1∶200倍稀釋的一抗anti-Nanog和anti-SSEA-1，37 ℃孵育45 min后， PBST漂洗3次。再以1∶100倍稀釋的FITC標記的二抗于37 ℃避光孵育45 min。PBST漂洗3次后，甘油封片，倒置顯微鏡下觀察、拍照。

表1 qRT-PCR鑒定所需基因引物及片段大小

Table 1 Primer information for qRT-PCR

基因名稱Genename堿基序列(5′→3′)Primersequence上游引物Forwardprimer下游引物Reverseprimer片段大小/bpSizeNanogF：TGGTTTCAGAACCAACGAATGAAGR：TGCACTGGTCACAGCCTGAAG180Sox2F：GAAGATGCACAACTCGGAGATCAGR：GAGCCGTTTGGCTTCGTCA100Oct4F：ACCAGCATCGAGACCAACGTGAR：TTGCAGAACCAGACCCGGACA117β?actinF：CAGCCATCTTTCTTGGGTATR：CTGTGATCTCCTTCTGCATCC164

1.2.5 核型分析 懸滴培養(yǎng)48 h后，用含有0.1 μg·mL-1秋水仙素的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)2～3 h。微量移液器將各組懸滴培養(yǎng)后形成的EB吸出，用0.25%胰酶消化細胞。參照徐琪等[15]方法進行核型分析。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理 所有數(shù)據(jù)均采用Office2010 Excel進行統(tǒng)計處理，以“平均值±標準誤”表示，采用SPSS19.0進行雙因素方差分析。

2 結 果

2.1 雞ESCs的特異性鑒定

培養(yǎng)至第3代的ESCs可形成明顯的細胞克隆，且克隆邊界清晰，呈鳥巢狀。對這些克隆進行多能性鑒定，結果顯示：經(jīng)AKP染色后，ESCs克隆呈現(xiàn)棕紅色(圖1A)；SSEA-1染色后，可在熒光顯微鏡下觀察到ESCs表面的綠色熒光(圖1B)。該結果表明第3代的ESCs克隆保持有干性，還處于未分化狀態(tài)。

2.2 懸滴培養(yǎng)制備類胚體

將培養(yǎng)至第3代雞ESCs細胞消化成單細胞，用普通培養(yǎng)液分別重懸細胞至1×104、3×104和6×104mL-13個細胞濃度，進行懸滴培養(yǎng)。采用倒置顯微鏡在0 、24和48 h觀察各組細胞的形態(tài)變化情況(圖2)。單個視野內(nèi)對形成的類胚體計數(shù)，統(tǒng)計24 和48 h類胚體的形成數(shù)量，每組3個重復。結果發(fā)現(xiàn)：1×104mL-1細胞濃度懸滴培養(yǎng)24 h出現(xiàn)少量有10～15個細胞構成的圓球狀類胚體，48 h類胚體數(shù)量增多，體積增大，隱約可見中心有囊腔形成(圖2A)；3×104mL-1細胞濃度懸滴培養(yǎng)24 h出現(xiàn)較多圓球狀類胚體，48 h類胚體體積增大，且數(shù)量增加，開始形成囊腔(圖2B)；6×104mL-1細胞濃度懸滴培養(yǎng)24 h細胞開始增殖，并開始出現(xiàn)細胞聚集，有單個類胚體形成，且類胚體體積較小，約由3～8個細胞構成，48 h出現(xiàn)少量圓球狀類胚體，此時類胚體體積小于其他兩組，未觀察到囊腔形成(圖2C)。對單個視野下類配體形成數(shù)量統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，懸滴培養(yǎng)24 h后，1×104mL-1細胞濃度單個視野下約有22個類胚體形成；3×104mL-1細胞濃度約有53個類胚體形成，顯著高于其他兩個試驗組；6×104mL-1細胞濃度下細胞開始增殖并形成細胞集落，僅有約3個類胚體形成。懸滴培養(yǎng)48 h后，各組類胚體體積增大，且數(shù)量有不同程度的增加，對1×104、3×104和6×104mL-13個細胞濃度形成的類胚體統(tǒng)計數(shù)分別為57、267和37。3×104mL-1細胞濃度懸滴培養(yǎng)48 h后，類胚體數(shù)量極顯著高于其他兩個試驗組(表2)。

A.ESCs的AKP染色結果；B.ESCs的SSEA-1染色結果(暗場)；C.ESCs的SSEA-1染色結果(明場)?！?ESCs克隆A.Stained ESCs by AKP；B.Stained ESCs by SSEA-1(dark field)；C.Stained ESCs by SSEA-1(light field).→.ESCs clone圖1 第3代雞ESCs的特異性鑒定400×Fig.1 Identification of the 3rd generation chicken ESCs 400×

A.1×104 mL-1細胞濃度懸滴培養(yǎng)24 h出現(xiàn)少量圓球狀類胚體，48 h類胚體數(shù)量增多，體積增大，隱約可見中心有囊腔形成；B.3×104 mL-1細胞濃度懸滴培養(yǎng)24 h出現(xiàn)較多圓球狀類胚體，48 h類胚體體積增大，且數(shù)量大量增加；C.6×104 mL-1細胞濃度懸滴培養(yǎng)24 h細胞開始增殖，并出現(xiàn)少量集落，48 h出現(xiàn)少量圓球狀類胚體?！?類胚體A.1×104 mL-1 cell concentration group started to form EB after 24 h，the volumn and number of EB both increased with 48 h； B.3×104 mL-1 cell concentration group formed more EB than the other groups within 24 h，and the EB’s number kept increasing within 48 h；C.6×104 mL-1 cell concentration goup only had a little EB after 24 h，and no sign for significant increase of EB within 48 h.→.EB圖2 不同細胞濃度不同時間點ESCs細胞形態(tài)變化400×Fig.2 The cell morphologic change at different time spots under different cell concentrations 400×

表2 不同細胞濃度不同時間點EBs形成數(shù)量

Table 2 The number of EB at different time spot under different cell concentrations

細胞濃度/(×104mL-1)Cellconcentration0h24h48h1022±357±23053±3?267±10??603±137±3

*.P<0.05；**.P<0.01

2.3 懸滴培養(yǎng)過程中相關全能性基因的qRT-PCR檢測

以β-actin為內(nèi)參基因，將0 h的ESCs細胞表達量設為空白對照，應用qRT-PCR技術對干細胞相關基因Nanog、Sox2、C-kit和Oct4的表達情況進行檢測，采用2-ΔΔCt法分析相對定量結果，SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析。結果顯示，1×104、3×104和6×104mL-13個細胞濃度48 h懸滴培養(yǎng)期間，干細胞相關基因Nanog、Sox2、C-kit和Oct4持續(xù)表達(圖3)。各組基因相對表達量如表3所示，1×104mL-1細胞濃度48 h懸滴培養(yǎng)后，Nanog、Sox2、C-kit和Oct4相對表達量分別為1.68、1.13、1.48和1.01；3×104mL-1細胞濃度48 h懸滴培養(yǎng)后，Nanog、Sox2、C-kit和Oct4相對表達量分別為1.76、1.10、1.52和1.05；6×104mL-1細胞濃度48 h懸滴培養(yǎng)后，Nanog、Sox2、C-kit和Oct4相對表達量分別為1.80、1.15、1.32和1.02，各組基因表達量無顯著性差異。

A.1×104 mL-1細胞濃度；B.3×104 mL-1細胞濃度；C.6×104 mL-1細胞濃度。圖4同A.1×104 mL-1 cell concentration；B.3×104 mL-1 cell concentration；C.6×104 mL-1 cell concentration.The same as Fig.4圖3 懸滴培養(yǎng)48 h ESCs的干性基因Nanog、Sox2、C-kit和Oct4的表達變化Fig.3 Relative expression levels of Nanog,Sox2,Oct4 and C-kit after 48 h hanging-drop culture

2.4 免疫細胞化學檢測特異性標記物的表達

對各細胞濃度懸滴培養(yǎng)48 h后的類胚體進行表面抗原SSEA-1和Nanog檢測。結果顯示，懸滴培養(yǎng)所形成的類胚體SSEA-1和Nanog檢測呈陽性反應，熒光下分別呈黃綠色和紅色；DAPI染色為藍色(圖4)。表明懸滴培養(yǎng)48 h所獲取的類胚體中的細胞處于未分化狀態(tài)。

2.5 類胚體自發(fā)分化驗證

獲取3×104mL-1細胞濃度懸滴培養(yǎng)獲得的類胚體，使用10% FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)過程中隔天換液，定期觀察類胚體的自發(fā)分化情況。并對自發(fā)分化獲得的細胞進行SOX17 (內(nèi)胚層)、SMA(Smooth Mmuscle Actin)(中胚層)和TUJ-1(βIII-tubulin)(外胚層) 免疫熒光鑒定(圖5)。間接免疫組化染色結果表明，類胚體自分化后內(nèi)胚層標記蛋白SOX17，中胚層標記蛋白SMA和外胚層標記蛋白TUJ-1表達呈陽性。結果表明，所獲得的類胚體具有分化為3個胚層的能力。

2.6 類胚體細胞核型分析

通過3×104mL-1細胞濃度懸滴培養(yǎng)獲得類胚體，對其染色體進行核型分析。選擇良好分裂相，在顯微鏡下計數(shù)染色體數(shù)目。結果表明，懸滴培養(yǎng)形成的類胚體具有并保持正常的核型，為38條常染色體和2條性染色體(圖6)。

3 討 論

類胚體是由胚胎干細胞體外培養(yǎng)獲得的，具有向多個方向分化的潛能。類胚體是ESCs細胞發(fā)育的啟動，在特定的細胞因子和微環(huán)境中可對其進行定向誘導，從而產(chǎn)生特定細胞。EB最早由A.Takeda[16]觀察并描述，被認為是一種卵巢腫瘤內(nèi)發(fā)生的現(xiàn)象；此后G.B.Pierce等[17]研究發(fā)現(xiàn)，EB可以用來形成畸胎瘤或畸胎癌；G.R.Martin等[18]克隆畸胎癌細胞進行體外培養(yǎng)形成了具有分化功能的EB；M.J.Evans和M.H.Kaufman[19]體外培養(yǎng)老鼠的胚胎干細胞形成EB。近年來，類胚體被廣泛應用于體外定向誘導過程，陳明等[6]通過類胚體的體外形成，誘導生成小鼠心肌細胞。陳惠芹等[8]通過添加誘導劑，促進擬胚體中原始造血干細胞發(fā)生。而現(xiàn)有研究中，針對家禽類胚體形成的研究較少，尚未見有詳細的報道。

本課題組一直致力于家雞雄性生殖細胞的分化研究，目前已初步建立雞ESCs向雄性生殖細胞分化的體外誘導體系，但是誘導效率較低，產(chǎn)生的雄性生殖樣細胞數(shù)量較少。因此，本研究在懸滴培養(yǎng)的基礎上，摸索雞ESCs形成類胚體的最佳體系，以期提高體外誘導雞ESCs生成雄性生殖細胞的誘導效率。采用1×104、3×104和6×104mL-13個細胞濃度，使用懸滴培養(yǎng)后觀察類胚體的形成效率。研究發(fā)現(xiàn)，在3×104mL-1的細胞濃度下，通過不含干細胞維持因子的培養(yǎng)液懸滴培養(yǎng)48 h，類胚體數(shù)量呈對數(shù)上升，表明3×104mL-1為雞ESCs體外懸滴培養(yǎng)形成類胚體的最適濃度，這與張良等[3]結論相符。

間接免疫熒光法檢測各試驗組懸滴培養(yǎng)48 h后，類胚體中干性標記蛋白的表達情況：綠色熒光為SSEA-1蛋白，紅色熒光為Nanog蛋白，藍色為DAPI染色，Merge代表合并圖?！?EBAfter 48 h hanging-drop culture,immunocytochemistry showed EB was positive for SSEA-1(green)，Nanog(red) and DAPI (blue) in all 3 groups，Merge were showed respectively.→.EB圖4 類胚體中的蛋白免疫細胞化學檢測 400×Fig.4 Expression of proteins in EB detected by immunocytochemistry 400×

類胚體自分化后檢測三胚層標記基因：SOX17 (內(nèi)胚層)、SMA (中胚層)和TUJ-1 (外胚層)的表達，藍色為DAPI染色，Merge代表合并圖After EB differetiated in vitro，the marker genes of 3 layer were detected by immunocytochemistry：SOX17 (endoderm)，SMA (mesoderm) and TUJ-1 ( ectoderm).DAPI (blue)，Merge were showed respectively圖5 類胚體體外自分化免疫熒光檢測200×Fig.5 Differentiation of EB in vitro detected by immunocytochemistry 200×

圖6 類胚體的染色體核型分析1 000×Fig.6 Karyotype analysis of EB 1 000×

為了克服普通懸滴培養(yǎng)法產(chǎn)生EB數(shù)量少，EB大小和分化階段不一致的問題，本研究對懸滴培養(yǎng)法進行了長時間的摸索和改進，采用第3代雞ESCs形成的克隆進行類胚體培養(yǎng)，能獲得相對較多的EB，且大小基本一致，可重復性高。對形成的類胚體進行qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，其持續(xù)表達干性基因Nanog、Sox2、Oct4和C-kit，且免疫細胞化學檢測Nanog和SSEA-1呈陽性。另外，對懸滴培養(yǎng)形成的類胚體進行核型分析，發(fā)現(xiàn)類胚體在形成過程中具有正常的核型。試驗結果表明，本研究采用懸滴培養(yǎng)法形成類胚體具有分化潛能，能夠用于體外定向誘導過程。

4 結 論

本研究采用懸滴培養(yǎng)法，成功建立雞胚胎干細胞類胚體體外快速形成技術，確定3×104mL-1為雞ESCs體外懸滴培養(yǎng)形成類胚體的最適濃度。所獲得的EB數(shù)量相對較多，大小均一，持續(xù)表達全能性標記基因并具有分化為3個胚層的能力，且染色體核型正常。該研究為進一步優(yōu)化雞ESCs向生殖細胞定向分化體系奠定了理論和試驗基礎。

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(編輯 程金華)

Embryoid Body Formation from Chicken Embryonic Stem Cells through Suspension Culture

ZHANG Lei1，2，WANG Xiao-yan1，ZUO Qi-sheng1，LU Zhen-yu1，WANG Fei1，JI Yan-qin1， WANG Ying-jie1，ZHANG Ya-ni1*，LI Bi-chun1*

(1.KeyLaboratoryofAnimalBreedingReproductionandMolecularDesignforJiangsuProvince，CollegeofAnimalScienceandTechnology，YangzhouUniversity，Yangzhou225009，China； 2.JiangsuAgri-animalHusbandryVocationalCollege,Taizhou225300,China)

This experiment was conducted to explore the best suspension culture system for embryoid body (EB) formation from chicken embryonic stem cells (ESCs)，and to improve the induction efficiency of chicken ESCsinvitro.Pure clones from the third generation of chicken ESCs was collected，re-suspensed the cells into 3 cell concentrations：1×104，3×104and 6×104mL-1to make suspension culture.Morphology changes of EB were observed，qRT-PCR and immunofluorescence methods were used to detect the marker genes’s expression，self-differentiation and karyotype analysis were made to make full test of EB.The results showed that,the amount of EB with 3×104mL-1cell concentration was higher than the other groups，and the number of EB reached 267 in one single view with the same spherical shape.The stem cell marker genesNanog,Sox2,Oct4 andC-kitremained expression with 48 h of EB formation，and stem cell surface specific antigen (NanogandSSEA-1) detection was positive.After self-differentiation of EB，3 embryonic germ layers specific antigen (SOX17,SMAandTUJ-1) detection all showed positive.Karyotype analysis showed that the formatted EB maintained normal karyotype.The results indicated that the suitable concentration for chicken ESCs form the EB through suspension culture was 3×104mL-1，and the formatted EB had viability to provide experimental foundation for chicken ESCs induction invitro.

embryoid body；suspension culture；chicken；embryonic stem cells

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.08.008

2014-12-11

國家自然科學基金(31272429；31472087)；江蘇省研究生科研創(chuàng)新基金(CXZZ13_0909)

張 蕾(1987-)，女，江蘇常州人，博士，主要從事胚胎干細胞體外誘導研究，E-mail：leizhang17@sina.com

*通信作者：張亞妮，講師，博士，主要從事動物遺傳工程研究；李碧春，教授，博士，主要從事動物胚胎工程與遺傳工程研究，E-mail：yubcli@yzu.edu.cn

S831.2

A

0366-6964(2015)08-1333-08