張莉 張成書 李旭文 王懷谷 徐靜 李光早 林曉曦

血管瘤是嬰幼兒最常見的良性腫瘤，其確切的發(fā)病機制目前尚未闡明[1]。血管瘤具有很奇特的自然病程：出生后1～12個月瘤體迅速增大（增生期），隨后的2～5年內(nèi)出現(xiàn)緩慢的、必然的消退（消退期）。由于這一特殊的生物學現(xiàn)象，血管瘤增生與消退的機制一直是人們研究的熱點。張莉等[2]用基因芯片技術(shù)檢測增生期和消退期血管瘤差異基因的表達,發(fā)現(xiàn)大量與細胞增殖相關(guān)的基因在增生期高表達，而與細胞凋亡有關(guān)的基因在消退期高表達，提示血管內(nèi)皮細胞的增殖和凋亡與血管瘤的增生和消退密切相關(guān)，即血管瘤的增生和消退可能就是血管瘤內(nèi)皮細胞增殖和凋亡的外在表現(xiàn)，但引起血管瘤內(nèi)皮細胞增殖和凋亡的分子機制尚不明確。

本實驗擬用免疫組織化學方法，檢測不同時期血管瘤組織中的Survivin、VEGF和活化Caspase-3的表達，并且進行相關(guān)性分析，探討上述分子的變化對血管瘤增生、消退病程演化的影響，為臨床治療血管瘤提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 研究對象

收集我院病理科2005年至2008年血管瘤蠟塊標本45例，其中女性35例，男性10例；年齡最小1月齡，最大5歲。依據(jù)Mulliken對血管瘤的分期標準，并經(jīng)病理證實，確診增生期血管瘤30例，消退期血管瘤15例。另以瘤體周圍正常皮膚組織15例為正常對照。

1.2 免疫組化染色

1.2.1 載玻片的處理

重鉻酸鉀-硫酸液浸泡24 h，用流水沖洗2 h，置于60℃溫箱中烤干，并以1∶10多聚L-賴氨酸溶液浸數(shù)秒，瀝干，置于60℃溫箱中烤干備用。

1.2.2 免疫組化染色

石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟和梯度乙醇水化后，蒸餾水沖洗3遍，滴加3%H2O2，室溫孵育10 min，置于抗原修復液，中火修復10 min，室溫冷卻20 min，蒸餾水沖洗2遍，0.1%PBS液沖洗2遍，甩去PBS液，滴加50 μL非免疫動物血清，室溫下孵育10 min，滴加一抗50 μL，4℃溫箱中過夜。切片取出后PBS沖洗3 min（3次），滴加生物素標記的第二抗體50 μL，室溫下孵育 10 min，PBS 液沖洗 3 min（3 次），滴加鏈霉素抗生物素-過氧化物酶溶液50 μL，室溫下孵育 10 min，PBS液沖洗 3 min（3次），滴加 100 μL新鮮配置的二氨基苯聯(lián)氨（DAB），顯色5 min，自來水沖洗，蘇木素復染，中性樹膠封片。分別設立陽性對照和陰性對照。陽性對照即試劑公司提供的陽性照片，陰性對照為一抗用PBS液。

1.2.3 染色結(jié)果的評定

由兩位病理科醫(yī)師采用雙盲法對結(jié)果進行評定。光鏡下觀察，免疫組織化學染色顯示：VEGF陽性時，細胞質(zhì)有棕黃色細顆粒沉著；Caspase-3陽性時，胞漿或胞核出現(xiàn)黃色、棕黃色、棕褐色細顆粒沉著；Survivin陽性時，胞核出現(xiàn)棕黃色、棕褐色細顆粒沉著。評定標準如下：以同一顯微鏡倍數(shù)（400×）觀察全片，選擇5個高倍視野，合并計算所分析的5個不同視野染色的強度及陽性細胞百分率?；静蝗旧邽?分，染色淡者為1分，染色中等者為2分，染色深者為3分。陽性細胞百分率小于5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為 2分，大于 51%為3分。將每張片子的染色強度得分與陽性細胞百分率得分各自相乘，則為陽性系數(shù)。陽性系數(shù)0～1分者為陰性（-），2～3 分者為弱陽性（＋），4～6 分者為中等陽性（＋＋），9 分者為強陽性（＋＋＋）。 陽性表達率以表達陽性的病例（包括弱陽性、中等陽性和強陽性之和）占總病例數(shù)的百分比表示。

1.3 統(tǒng)計學分析

以SPSS 11.5軟件對數(shù)據(jù)進行處理，統(tǒng)計方法為Kuskal-Wallis H檢驗、Mann-Whittney U檢驗、Spearman等級相關(guān)分析，P<0.05為有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 Survivin在血管瘤和正常組織中的表達

Survivin主要在血管瘤內(nèi)皮細胞胞核中表達，增生期陽性（+～＋＋＋）表達率為 80%（24/30）；消退期陽性（+～＋＋＋）表達率為 60%（9/15）；在正常組織中不表達。血管瘤增生期與消退期的差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；增生期和消退期分別與正常組織比較，差異均有顯著意義（P<0.01）（表 1）。

表1 Survivin在血管瘤及正常組織中的表達

2.2 VEGF在血管瘤和正常組織中的表達

VEGF主要在血管瘤內(nèi)皮細胞的胞漿和胞膜表達，增生期和消退期陽性（+～＋＋＋）表達率分別為90%（27/30）和 46.7%（13/15），具有顯著性差異（P<0.01）；在正常組織不表達。增生期與消退期血管瘤與正常組織相比，差異均具有顯著意義（P<0.01）（表2）。

表2 VEGF在血管瘤及正常組織中的表達

2.3 活化Caspase-3在增生期、消退期血管瘤及正常組織中的表達

血管瘤中活化Caspase-3增生期主要在內(nèi)皮細胞核中表達，消退期也出現(xiàn)在胞漿中，增生期和消退期陽性（+～＋＋＋）表達率分別為 60.0%(18/30)和 86.7%(13/15)，在正常組織中不表達。血管瘤在增生期與消退期的差異具有顯著意義（P<0.01），增生期、消退期與正常組織的差異均有顯著意義（P<0.01）（表3）。

表3 活化Caspase-3在血管瘤及正常組織中的表達

2.4 血管瘤組織中Survivin和VEGF的相關(guān)性

經(jīng)Spearman等級相關(guān)分析，Survivin和 VEGF在45例血管瘤組織的表達具有正相關(guān)性 （r=0.54，P<0.01）（表 4）。

表4 血管瘤中Survivin和VEGF表達的相關(guān)性

2.5 血管瘤組織中Survivin和活化Caspase-3的相關(guān)性

經(jīng)Spearman等級相關(guān)分析，Survivin和活化Caspase-3在45例血管瘤組織的表達具有負相關(guān)性（r=-0.51，P<0.01）（表 5）。

表5 血管瘤中Survivin、Caspase-3表達的相關(guān)性分析

3 討論

血管瘤增生和消退的確切發(fā)病機制目前尚不明確，血管內(nèi)皮細胞增殖和凋亡相關(guān)因子在該機制中的作用是目前研究的熱點。

本實驗發(fā)現(xiàn)，VEGF在增生期血管瘤的陽性率為90%（27/30），明顯高于消退期和正常組織，與文獻報道一致[3]。Caspase-3是細胞凋亡的重要信號分子，其活化可誘導血管瘤內(nèi)皮細胞發(fā)生凋亡，并可能最終導致血管瘤的自發(fā)消退[4]。本實驗顯示，活化Caspase-3在消退期的陽性率為86.7%，明顯高于增生期血管瘤（60.0%）和正常組織（不表達）。Survivin是新近發(fā)現(xiàn)的、最強的凋亡抑制蛋白，表達不足可導致內(nèi)皮細胞及新生毛細血管的退化[5]。我們發(fā)現(xiàn)，其在增生期血管瘤中的陽性表達率（80%）明顯高于消退期（60%）和正常組織（不表達），提示Survivin可抑制血管瘤內(nèi)皮細胞凋亡，促進血管瘤組織增生，是調(diào)控血管瘤內(nèi)皮細胞凋亡的重要基因之一。

通過等級相關(guān)分析，我們發(fā)現(xiàn)血管瘤組織中VEGF和Survivin的表達具有強正相關(guān)性，提示血管瘤內(nèi)皮細胞中Survivin的高表達可能與VEGF表達上調(diào)有關(guān)。VEGF刺激血管瘤內(nèi)皮細胞增生，還通過Survivin抑制了內(nèi)皮細胞的凋亡，它們共同作用促成了血管瘤早期的快速增生。Survivin在增生期血管瘤高表達，在退化期血管瘤中低表達；而活化Caspase-3的表達則相反，兩者的表達呈負相關(guān)，證實在血管瘤的增生過程中，Survivin可能通過抑制Caspase-3而參與了血管瘤的發(fā)生；相反，血管瘤的消退則可能是由于Survivin的表達降低，Caspase-3的活性增高，誘導血管瘤內(nèi)皮細胞凋亡所致。

我們對比了血管瘤增生期和消退期中Survivin、VEGF、Caspase-3的表達及其相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)三者在血管瘤的不同時期表達不同，且具有相關(guān)性，其差異變化可能主導了血管瘤增生、消退的演化過程。結(jié)果提示，血管瘤內(nèi)皮細胞中高表達的VEGF一方面促進自身的增殖，另一方面上調(diào)了Survivin的表達，抑制了Caspase-3等凋亡蛋白的活性，從而導致了血管瘤早期的快速增生；相反，VEGF的表達下調(diào)，減少了凋亡抑制蛋白Survivin的表達，使凋亡蛋白Caspase-3等活性升高，促進了內(nèi)皮細胞的凋亡，使血管瘤趨于消退。結(jié)合文獻分析[6-7]，可以推測，在血管瘤的增生與消退過程中，VEGF/Survivin抑制Caspase-3的途徑可能起著關(guān)鍵性的作用，將來有望通過改變VEGF/Survivin抑制Caspase-3的途徑中的某一環(huán)節(jié)，如用反義核苷技術(shù)和/或RNA干擾技術(shù)等阻斷VEGF或Survivin在血管瘤中的表達，提高Caspase-3的活性，誘發(fā)血管瘤內(nèi)皮細胞的凋亡，促進血管瘤的早日消退，為血管瘤的基因治療開辟新的途徑。

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