周艷麗 滕軍放 婁季宇

1)鄭州市第十人民醫(yī)院 鄭州 450052 2)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 鄭州 450052 3)鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 鄭州 450014

近年來研究發(fā)現(xiàn)In除了發(fā)揮調(diào)節(jié)血糖的作用外,對(duì)缺血性腦血管病腦損傷有保護(hù)作用,但其作用機(jī)制尚未完全明了。本實(shí)驗(yàn)擬通過體外培養(yǎng)神經(jīng)元,以缺氧/復(fù)氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)模擬缺血再灌注損傷(ischemia-reperfusion injury,IRI),觀察 In對(duì)神經(jīng)元凋亡、HMGB1和 NF-κB表達(dá)的影響,探討In對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)保護(hù)的作用機(jī)制,為其治療急性缺血性腦血管病提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 出生24h內(nèi)的SD大鼠(鄭州大學(xué)動(dòng)物中心);抗NSE、抗NF-κB、抗 HMGB1多克隆抗體(博奧森);TUNEL檢測(cè)試劑盒(Roche);SP免疫組化試劑盒(博奧森);正規(guī)胰島素注射液(上海第一生化)。

1.2 原代大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元的培養(yǎng)與鑒定 采用Lee JM的方法[1]:取新生SD大鼠腦組織制成細(xì)胞懸液,接種在24或96孔板中培養(yǎng)。7d后用NSE抗體進(jìn)行細(xì)胞免疫組化染色,計(jì)數(shù)陽性神經(jīng)元達(dá)85%以上符合實(shí)驗(yàn)要求。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組 將培養(yǎng)7d的神經(jīng)元隨機(jī)分為3組。A組:將培養(yǎng)液換為有糖 Earle's液后培養(yǎng);B組:單純 H/R,將培養(yǎng)液換為無糖Earle's液放入缺氧袋中,通入95%N2+5%CO2后繼續(xù)培養(yǎng);C組:予1mU/L的In預(yù)處理1h后再予H/R。50min后以上 3組重新?lián)Q回正常培養(yǎng)基,繼培養(yǎng) 24h。分別于復(fù)氧后 0、3、6、12、24h各時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)凋亡神經(jīng)元、HMGB1和 NF-κB的表達(dá)。單純 H/R模型成功標(biāo)準(zhǔn):H/R 0、24h MT T檢測(cè)細(xì)胞存活率,分別下降至 90%、60%以下。

1.4 TUNEL法檢測(cè)凋亡細(xì)胞 嚴(yán)格按照說明書操作。用已知的陽性圖片做陽性對(duì)照,陰性對(duì)照采用試劑盒中2液代替反應(yīng)液。陽性凋亡細(xì)胞被染為棕黃色。光學(xué)顯微鏡下,每個(gè)培養(yǎng)孔隨機(jī)選取3個(gè)不連續(xù)的視野,計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞中染色的細(xì)胞數(shù)。

1.5 細(xì)胞免疫組化檢測(cè)HMGB1和NF-κB的表達(dá) 嚴(yán)格按照說明書操作。用已知的陽性圖片做陽性對(duì)照,陰性對(duì)照采用PBS液代替一抗。HMGB1陽性細(xì)胞胞漿被染為棕黃色,NF-κB陽性細(xì)胞胞核被染為棕黃色。光學(xué)顯微鏡下,每個(gè)培養(yǎng)孔隨機(jī)選取3個(gè)不連續(xù)的視野,計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞中染色細(xì)胞的數(shù)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 10.0軟件分析,數(shù)據(jù)以表示,多組間計(jì)量資料比較采用隨機(jī)測(cè)量的方差分析。用LSD-t檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較,α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 培養(yǎng)7d神經(jīng)元NSE鑒定 陽性率為(91.70±3.60)%。

2.2 各組大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡數(shù)目 見表1。

表1 各組大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡數(shù)目比較 ()

表1 各組大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡數(shù)目比較 ()

與A組比較,★P＜0.05;與B組比較,☆P＜0.05

2.3 各組大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元HMGB1的表達(dá) 見表2。

表2 各組大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元HMGB1胞漿表達(dá)的比較 ()

表2 各組大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元HMGB1胞漿表達(dá)的比較 ()

與A組比較,★P＜0.05;與B組比較,☆P＜0.05

2.4 各組大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元NF-κB的表達(dá) 見表3。

表3 各組大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元NF-κB胞核表達(dá)的比較 ()

表3 各組大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元NF-κB胞核表達(dá)的比較 ()

與A組比較,★P＜0.05;與B組比較,☆P＜0.05

組別 n 0h 3h 6h 12h 24h A 組 15 37.87±10.97 38.27±6.83 39.47±10.95 37.47±9.68 38.67±8.42 B組 15 41.47±9.29 56.67±10.76★ 71.47±14.41★ 86.07±12.43★ 85.93±13.19★C組 15 41.21±8.11 41.33±9.10☆ 42.45±10.24☆ 42.77±10.54☆ 43.25±12.80☆F值 0.52 17.71 22.29 66.18 65.53 P＞0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

3 討論

Goldberg MP等[2]的方法能很好的模擬腦IRI,本實(shí)驗(yàn)依據(jù)此建立體外神經(jīng)元IRI模型。

In已廣泛應(yīng)用于臨床,在糖尿病治療中發(fā)揮著及其重要的作用。近年來研究表明[3]胰島素還可減輕缺血性腦損傷,該作用獨(dú)立于它的降血糖作用之外。In能使缺血性腦卒中缺血半暗區(qū)血流增加,Ca2+超載減輕,興奮性氨基酸及NO的毒性作用抑制;增強(qiáng)腦源性神經(jīng)生長因子作用;可通過PI3K/Akt途徑使JNK1/2、Caspase-3等的表達(dá)下調(diào),Bcl-2表達(dá)上調(diào)而抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡,起到腦保護(hù)作用。本研究發(fā)現(xiàn),與A組相比,B組H/R后3h凋亡細(xì)胞增多,并隨著H/R時(shí)間的延長逐漸增多,提示缺血再灌注導(dǎo)致了神經(jīng)元凋亡,這與腦缺血再灌注后神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生凋亡的規(guī)律基本一致。C組應(yīng)用In預(yù)處理后,發(fā)現(xiàn)凋亡細(xì)胞較B組明顯減少。這提示In可抑制細(xì)胞凋亡,減輕缺血再灌注對(duì)神經(jīng)元的損傷。

HMGB1是一種非組蛋白DNA結(jié)合蛋白,近期研究發(fā)現(xiàn)HMGB1在IRI中起重要作用。有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[4]觀察到HMGB1在腦缺血再灌注中由損傷和壞死的神經(jīng)元胞核中轉(zhuǎn)移至胞漿再釋放至胞外,導(dǎo)致神經(jīng)元的壞死和凋亡,抗-HMGB1單克隆抗體可縮小梗死區(qū)域,減輕腦損傷。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),B組神經(jīng)元胞漿HMGB1表達(dá)較A組顯著增加,C組應(yīng)用In預(yù)處理后神經(jīng)元胞漿HMGB1表達(dá)明顯減少,提示In可抑制神經(jīng)元HMGB1的胞漿表達(dá),從而減輕神經(jīng)元凋亡損傷。

NF-κB是一種真核轉(zhuǎn)錄因子,靜息狀態(tài)是存在于細(xì)胞質(zhì)中,激活后移位至胞核與DNA結(jié)合產(chǎn)生一系列生物學(xué)作用。研究表明NF-κB持續(xù)激活后可通過調(diào)控細(xì)胞周期、促進(jìn)細(xì)胞因子釋放、誘導(dǎo)促凋亡基因的表達(dá)等導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡[5]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),與A組相比,B組神經(jīng)元胞核NF-κB表達(dá)明顯增加;C組應(yīng)用In預(yù)處理后神經(jīng)元胞核NF-κB表達(dá)較B組明顯減少;提示In可通過下調(diào)神經(jīng)元NF-κB的胞核表達(dá)減少神經(jīng)元凋亡。

綜上In可減輕H/R所致神經(jīng)元凋亡,對(duì)腦IRI有保護(hù)作用,機(jī)制之一可能與抑制神經(jīng)元 HMGB1的胞漿表達(dá)和NF-κB的胞核表達(dá)有關(guān)。

[1]Lee JM,Shih AY,Murphy T H,et al.NF-E2-related factor-2 mediates neuroprotection against mitochondrial complex I inhibitors and increased concentrations of intracellular calcium in primary cortical neurons[J].J Biol Chem,2003,278(39):37948-37956.

[2]Goldberg MP,Choi DW.Combined oxygen and glucose deprivation in cortical cell culture:calcium-dependent and calciumindependent mechanisms of neuronal injury[J].Neurosci,1993,13(8):3510-3524.

[3]Hui L,Pei DS,Zhang QG,et al.The neuroprotection of insulin on ischemic brain injury in rat hippocampus through negative regulation of JNK signaling pathway by PI3K/Akt activation[J].Brain Res,2005,1052(1):1-9.

[4]Liu K,Mori S,Takahashi HK,et al.Anti-high mobility group box 1 monoclonal antibody amelio rates brain infarction induced by transient ischemia in rats[J].T he FASEB Journal,2007,21(14):3904-3916.

[5]李軍,婁季宇,張磊.雌激素對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷腦組織NF-κB表達(dá)和細(xì)胞凋亡的影響[J].中國實(shí)用神經(jīng)病雜志,2007,10(3):100-102.

[6]Aoki E,Yano R,Yokoyama H,et al.Role of nuclear transcription factor kappa B(NF-kappaB)for MPTP(1-methy l-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahy ropyridine)-induced apoptosis in nigral neurons of mice[J].Exp M ol Pathol,2009,86(1):57-64.