張俊清 王 偉 薛 鋼 孫智敏

包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 包頭 014010

γ-氨基丁酸(GABA)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中重要的抑制性氨基酸,在神經(jīng)元損傷中與主要的興奮性遞質(zhì)谷氨酸(Glu)相抗衡。GABA可阻斷Glu興奮性毒性,抑制細(xì)胞膜去極化和Ca2+內(nèi)流,具有神經(jīng)保護(hù)作用。介導(dǎo)GABA中樞效應(yīng)的受體至少有三種不同類型,即 GABAA、GABAB、GABAC受體,其中以GABAA受體分布最為廣泛,在缺血性腦損傷的神經(jīng)保護(hù)中占主導(dǎo)地位。哺乳類大腦中天然GABAA受體主要是由α、β和γ亞基組成。其中α亞基對GABAA受體復(fù)合物的組裝及功能可能起主要作用。α1與β2和γ2組成的GABAA受體亞型在腦內(nèi)數(shù)量最多,尤其在海馬和大腦皮質(zhì)最為豐富,約占全部GABAA受體的43%。對GABAA型受體α1亞基基因的研究,目前多集中在癲[1]、抑郁癥[2-4]等方面,在缺血性腦血管方面研究甚少。本研究以線栓法建立大腦 MCAO模型,采用原位雜交技術(shù)對大鼠腦組織中GABAARα1mRNA進(jìn)行檢測,來觀察γ-氨基丁酸A型受體基因在腦缺血再灌注損傷中的動態(tài)變化規(guī)律及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 研究對象 健康Wistar雄性大白鼠55只,體質(zhì)量260～310g,由內(nèi)蒙古大學(xué)動物試驗(yàn)中心提供。將動物隨機(jī)分為:正常對照組,腦缺血 2h 再灌注 6h、12h、24h、3d、7d組(手術(shù)組)及假手術(shù)對照組,每組5只。

1.2 方法

1.2.1 動物模型制作:采用右側(cè)大腦中動脈線栓法(MCAO),大鼠用10%水合氯醛(0.3ml/100g)腹腔注射麻醉,取仰臥位固定于鼠臺,碘伏消毒后頸部正中切口,暴露右頸總動脈、頸內(nèi)動脈和頸外動脈,結(jié)扎頸總動脈和頸外動脈近心端,血管夾夾閉頸內(nèi)動脈,在近頸總動脈分叉處留置一條結(jié)扎線以便插線后固定魚線,在頸總動脈近分叉處剪一約0.3mm小口,將頭部蘸有石蠟的魚線(線直徑0.26mm,長50mm)經(jīng)小口處插入,沿頸內(nèi)動脈入顱,進(jìn)線深度由分叉處算約20mm,稍感阻力時停止,此時已至大腦中動脈起始處,以活結(jié)結(jié)扎用于固定魚線的結(jié)扎線,縫合手術(shù)切口,缺血2h后將線栓抽出,松開頸總動脈上的活結(jié)造成缺血再灌注模型,假手術(shù)對照組除不插魚線外,其余步驟同缺血組。

1.2.2 標(biāo)本取材和石蠟切片制作:分別在上述規(guī)定時間點(diǎn),給予大鼠10%的水合氯醛0.5ml腹腔注射麻醉,剪開胸腔經(jīng)左心室快速輸入0.9%氯化鈉注射液,同時剪開右心耳,待血色變淡后快速輸入4%多聚甲醛磷酸緩沖液(含有1/1000DEPC)固定腦組織,待鼠頸及四肢僵硬后,停止灌注,快速斷頭取腦置于 4%多聚甲醛磷酸緩沖液(含有 1/1000DEPC)固定保存。取視交叉前后約4mm厚腦組織經(jīng)常規(guī)脫水、浸蠟、包埋。石蠟切片連續(xù)冠狀切片,42℃溫水展開,片厚 6μm,將石蠟切片貼于涂有多聚賴氨酸的切片上,置于60℃烤箱內(nèi)過夜,放4℃冰箱待用。

1.2.3 原位雜交過程:①石蠟切片經(jīng)常規(guī)脫蠟至水。30%H2O21份+蒸餾水10份混合,室溫10min以滅活內(nèi)源性酶。蒸餾水洗3次。②暴露mRNA核酸片段:切片上滴加1ml3%檸檬酸,100ul新鮮稀釋的胃蛋白酶混勻,37℃或室溫消化10min,原位雜交用PBS洗5min×3次,蒸餾水洗滌3次。③預(yù)雜交:干的雜交盒底部加20%甘油20ml以保持濕度。按每張切片20ul加預(yù)雜交液。恒溫箱42℃4h。吸取多余液體,不洗。④雜交:按每張切片20ul雜交液,加在切片上。將原位雜交專用蓋玻片的保護(hù)膜揭開后,蓋在切片上。恒溫箱42℃雜交過夜。⑤雜交后洗滌:揭掉蓋玻片,37℃左右水溫2×SSC洗滌5min×2次;37℃0.5×SSC洗滌15min×1次;37℃0.2×SSC洗滌 15min×1次。⑥滴加封閉液:37℃30min。甩去多余液體,不洗。⑦滴加生物素化鼠抗地高辛:37℃60min,原位雜交用 PBS洗5min×4次。⑧滴加SABC:37℃20min,原位雜交用PBS洗 5min×3次。⑨滴加生物素化過氧化物酶:37℃20min,原位雜交用PBS洗5min×4次。⑩DAB顯色:使用 DAB顯色試劑盒,1ml蒸餾水加顯色劑A、B、C各一滴,混勻,加至標(biāo)本上。顯色20min,充分水洗。?蘇木素復(fù)染,充分水洗。?酒精脫水,二甲苯透明,封片PBS洗3次×5min。蒸餾水洗1次。

1.2.4 觀察項(xiàng)目和統(tǒng)計學(xué)處理:在400倍顯微鏡視野下計數(shù)各組腦組織海馬區(qū)及大腦皮層GABAARα1mRNA陽性神經(jīng)元數(shù)及觀察GABAARα1mRNA分別在相應(yīng)海馬區(qū)及大腦皮質(zhì)陽性神經(jīng)元表達(dá)的改變。采用江蘇捷達(dá)科技公司的形態(tài)分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析,每張切片隨機(jī)選取10個高倍視野,測量原位雜交的陽性神經(jīng)元數(shù)目。采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計處理,各組數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,所用統(tǒng)計學(xué)方法用方差分析,P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 陽性細(xì)胞計數(shù)比較 與正常對照組相比,假手術(shù)對照組GABAARα1mRNA的表達(dá)無明顯改變(P＞0.05),但與正常對照組及假手術(shù)對照組比,腦缺血2h再灌注24h海馬區(qū)及大腦皮質(zhì)GABAARα1mRNA的陽性神經(jīng)元數(shù)目減少,3d降至最低(P＜0.05),14d基本恢復(fù)正常水平(P＞0.05)。

表1 大鼠海馬區(qū)GABAARα1mRNA的陽性神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)比較(個/每視眼)

表2 大腦皮質(zhì)GABAARα1mRNA的陽性神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)比較(個/每視眼)

2.2 組織形態(tài)學(xué)改變 光鏡下正常對照組和假手術(shù)組神經(jīng)元形態(tài)學(xué)無異常,陽性細(xì)胞胞漿著色呈棕黃色;手術(shù)組海馬區(qū)及大腦皮層部分神經(jīng)元結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出壞死前樣改變,包括細(xì)胞核濃縮、胞漿著色變淡、細(xì)胞結(jié)構(gòu)不清,尤其在再灌注24h及3d時為著,缺血重的組織內(nèi)甚至可見液化性壞死灶,灶內(nèi)神經(jīng)元?dú)埓孑^少甚至缺失。

3 討論

數(shù)十年來,人們對急性缺血性腦卒中病理生理機(jī)制的研究越來越深入,這應(yīng)歸功于腦缺血模型的制備。大鼠由于具有與人類腦血管相似的解剖基礎(chǔ)及側(cè)支循環(huán)情況、生理參數(shù)易控制性、價格低廉易得到而被廣泛用來作為缺血動物模型的制作。目前,研究應(yīng)用最多的是血管內(nèi)線栓法造成MCAO局灶性模型。該模型無需開顱,對機(jī)體損傷性小,形成梗死灶較恒定,不會影響其他血管供血區(qū)域的局部腦血流量,且能控制缺血時間,形成有效再灌注。一方面,MCAO模型與人類臨床常見的單一動脈,尤其是大腦中動脈閉塞一致,能較好模擬基底節(jié)區(qū)梗死;另一方面,人類大腦中動脈梗死常有自發(fā)性再灌注情況,MCAO模型通過線栓拔出實(shí)現(xiàn)血液再通,能夠滿足這一需求。因此,MCAO局灶性腦缺血模型被廣泛用于神經(jīng)元對缺血的敏感性、耐受性以及再灌注損傷病理機(jī)制和藥物干預(yù)治療等方面的研究。本研究以線栓法建立大腦中動脈栓塞模型,缺血2h再灌注不同時間點(diǎn),大鼠不同程度的表現(xiàn)有缺血對側(cè)肢體功能癱瘓的神經(jīng)功能缺失現(xiàn)象,證明了模型制作成功。

有研究顯示[5],短暫性腦缺血后,GABAA 受體α1、α2亞單位mRNA呈雙相變化。缺血早期發(fā)生再灌注后1h,主要表現(xiàn)為CA1和CA3區(qū)錐體細(xì)胞和顆粒細(xì)胞上mRNA表達(dá)降低;缺血晚期時,CA3區(qū)細(xì)胞mRNA表達(dá)開始恢復(fù)至對照水平,而在CA1區(qū)兩種mRNA的表達(dá)仍較低,可持續(xù)到缺血后第3天,與CA1區(qū)錐體細(xì)胞分布一致。而Elena Alekseevna Kharlamov等[6]研究顯示,光化學(xué)誘導(dǎo)血栓性腦梗死后,GABAARα1mRNA在梗死后7d下降明顯,30d開始上升,說明缺血損傷后,其代償機(jī)制具有復(fù)雜的時間依從性,GABAARα1mRNA在梗死后7d下降,可能由于 mRNA轉(zhuǎn)錄水平下降或者是mRNA穩(wěn)定性下降導(dǎo)致。本研究結(jié)果顯示,腦缺血2h再灌注24h時,GABAAR α1mRNA含量降低,3d時降至最低,推測,GABAARα1mRNA含量的變化與腦缺血再灌注損傷有關(guān)。與先前的研究相比較,GABAAR α1mRNA含量降低及恢復(fù)正常的時間段不同,這可能與所采用的試驗(yàn)方法與技術(shù)以及缺血模型制作方法不同有關(guān)。

本試驗(yàn)應(yīng)用原位雜交技術(shù)充分證實(shí)大鼠腦缺血再灌注24h～3d時腦組織中GABAARα1mRNA的表達(dá)降低,提示缺血再灌注后GABAAR α1mRNA轉(zhuǎn)錄受阻或其穩(wěn)定性下降所致。若利用堿基配對原則人工合成氨基酸,作用于GABAAR α1mRNA轉(zhuǎn)錄過程,減輕腦缺血后再灌注損傷,可能達(dá)到腦保護(hù)作用。

[1]Brooks-Kayal AR,Shumate MD,Jin H,et al.Coulter DA(1999)Human neuronal-aminobutyric acid A receptors:coordinated subunit mRNA expression and functional correlates in individual dentate granule cells[J].J Neurosci,1999,19:8312-8318.

[2]Brambilla P,Perez J,Barale F,et al.GABAergic dysfunction in mood disorders[J].Mol Psychiatry,2003,8:721-737.

[3]Tunnicliff G.Malatynska E.Central GABAergic systems and depressive illness[J].Neurochem Res,2003,28:965-976.

[4]Zul Merali,Lisheng Du,Pavel Hrdina,et al.Dysregulation in the suicide brain:mRNA expression of corticotropin-releasing hormone receptors and GABA A receptor subunits in frontal cortical brain region[J].Journal of Neuroscience,2004,24(6):1478-1485.

[5]Li H,Siegel RE,Schwartz RD.Rapid decline of GABAA receptor subunit mRNA expression in hippocampua following transient cerebralischemia in the gerbil[J].Hippocampus,1993,3(4):527.

[6]Elena Alekseevna Kharlamov,Kathy Louise Downey,Peter I-saac Jukkola.Expression of GABAA receptor α1subunit mRNA and protein in rat neocortex following photothrombotic infarction[J].Neuroscience,2008,19:29-38.