蔣祥龍，彭 炬，潘 藝，盧光琇

（中南大學(xué)生殖與干細(xì)胞工程研究所，人類干細(xì)胞國家工程研究中心，湖南 長沙 410078）

惡性腫瘤是一類嚴(yán)重危害人類生命健康的常見病，在腫瘤的臨床治療過程中，對各種已確診的腫瘤患者，所采取的主要治療手段是單獨(dú)或聯(lián)合運(yùn)用腫瘤外科手術(shù)切除，激素治療、放療、化療。總的說來，用傳統(tǒng)的方法治療原發(fā)性的、未轉(zhuǎn)移的腫瘤都取得了一定的療效。雖然傳統(tǒng)的治療在臨床上是有效的，但是當(dāng)腫瘤發(fā)展到惡性浸潤和轉(zhuǎn)移狀態(tài)時(shí)，將對傳統(tǒng)的治療藥物產(chǎn)生耐受性并易復(fù)發(fā)，而加大治療藥物的劑量又將殺死大量的正常細(xì)胞，最終導(dǎo)致腫瘤患者的死亡。由于傳統(tǒng)的治療方法的局限性，腫瘤的基因治療越來越引起了人們的注意。研究表明，腫瘤干細(xì)胞是惡性腫瘤轉(zhuǎn)移及擴(kuò)散的根源[1，2]。多潛能的人惡性畸胎瘤細(xì)胞NTERA-2來源于睪丸畸胎瘤，具有類似人胚胎干細(xì)胞的特點(diǎn)，體外培養(yǎng)具有自我更新及誘導(dǎo)分化為三個(gè)胚層的能力，被認(rèn)為是人胚胎干細(xì)胞的惡性對照物以及研究腫瘤干細(xì)胞理想的模型[3]。

腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（Tumor Necrosis Factor-related Apoptosis-Inducing Ligand TRAIL/ApoL）是腫瘤壞死因子家族一個(gè)典型的Ⅱ型膜蛋白[4]，具有引起大多數(shù)腫瘤細(xì)胞凋亡，而對正常組織細(xì)胞無細(xì)胞毒的特性。TRAIL/ApoL的膜外部分即可溶性TRAIL（sTRAIL氨基酸序列114-281）[5]，在血液中以同源三聚體的形式存在[6，7]，是引起腫瘤細(xì)胞凋亡的功能片段。

大鼠 progression-elevated gene-3（PEG3）基因的啟動(dòng)子是已被鑒定的、在癌癥細(xì)胞中特異性高表達(dá)的啟動(dòng)子。螢光素雙報(bào)告基因系統(tǒng)研究表明，PEG3啟動(dòng)子在大多數(shù)腫瘤細(xì)胞系中活性高，而在正常組織的細(xì)胞中活性低或檢測不到活性，因此，PEG3啟動(dòng)子可能是腫瘤基因治療的理想啟動(dòng)子，在腫瘤的基因治療中，可能特異地在腫瘤細(xì)胞中啟動(dòng)抑癌基因的表達(dá)。

然而，在用PEG3啟動(dòng)子來啟動(dòng)sTRAIL基因時(shí)，能否引起NTERA-2凋亡并對人正常細(xì)胞如胚胎成纖維細(xì)胞（hSF）及胚胎干細(xì)胞（hESC）無細(xì)胞毒作用，還有待實(shí)驗(yàn)證明。本文用PEG3啟動(dòng)子和sTRAIL基因構(gòu)建了pAAV-PEG3-sTRAIL質(zhì)粒，為進(jìn)一步的研究打下了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與細(xì)胞培養(yǎng)

hSF和NTERA-2細(xì)胞貼壁生長于含12%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，每2～3 d傳代1次，細(xì)胞培養(yǎng)于37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中。人胚胎干細(xì)胞由人類干細(xì)胞國家工程研究中心提供。

1.2 質(zhì)粒和試劑

大腸桿菌DH5α和腺相關(guān)病毒載體pAAV為本實(shí)驗(yàn)室保存；RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit購自Fermentas公司；FUGENE HD轉(zhuǎn)染試劑購自 Roche 公司；kpnI、BamHI、HindⅢ限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶和質(zhì)粒抽提試劑盒購自寶生物公司；Annexin-Ⅴ-FITC早期凋亡檢測試劑盒購自Bender MedSysteme公司；DMEM高糖培養(yǎng)液和胎牛血清購自Gibco Invitrogen公司。

1.3 PCR引物的合成

由上海生工公司合成。

PEG3啟動(dòng)子引物：上游引物為5'-GGTACCTGTTGTTTTCCTCTCTCCACCT?-3'，下游：引物為5'-GTCGACGGTTCGGTTTGCCAAAAG?-3'。sTRAIL基因引物：上游引物為5'-GGATCCATGGTGAGAGAAAGAGGTCCTCAG-3'，下游引物為5'-AAGCTT TTAGCCAACTAAAAAGGCCCCGA-3'。在sTRAIL基因的兩端加上BamHI和HindⅢ酶切位點(diǎn)。

1.4 大鼠基因組DNA的提取及PEG3啟動(dòng)子的擴(kuò)增

用鋒利的眼科手術(shù)剪，呈45度角剪取大鼠尾部約1 cm長，放入Eppendorf管中，于55℃水溶中，用500μL STE溶液，含有（5μL 10 mg/mL蛋白酶K）中消化過夜，再按常規(guī)DNA提取方法抽取基因組DNA（gDNA），溶于TE緩沖液后，用紫外分光光度計(jì)測定濃度，4℃保存。PEG3啟動(dòng)子擴(kuò)增條件如下：95℃預(yù)變性2 min后，94℃變性30 s，63℃退火30 s，72℃延伸 30 s，完成 35 個(gè)循環(huán)。72℃ 5 min，置4℃保溫。

1.5 sTRAIL基因的擴(kuò)增

將常規(guī)方法提取的細(xì)胞總RNA溶于無RNAse的水中，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，紫外分光光度計(jì)測定A260/A280的比值應(yīng)在1.8～2.0之間。取總RNA 2μg，按說明書將其逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。sTRAIL基因的擴(kuò)增條件如下：95℃預(yù)變性2 min 后，94℃變性 30 s，60℃退火 30 s，72℃延伸 30 s，完成35個(gè)循環(huán)，72℃ 5 min，置4℃保溫。

1.6 pAAV-PEG3-sTRAIL質(zhì)粒的構(gòu)建

將PEG3啟動(dòng)子和sTRAIL基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物連接到pMD18-T載體上，以此構(gòu)建T-PEG3和T-sTRAIL質(zhì)粒，測序以保證PEG3啟動(dòng)子和sTRAIL基因序列正確。先以kpnI和BamHI雙酶切pAAV載體和T-PEG3質(zhì)粒，然后，將T載體上已測序正確的PEG3啟動(dòng)子克隆到pAAV載體中替代CAG啟動(dòng)子，得到pAAV-PEG3空載體。然后，以BamHI和HindⅢ雙酶切pAAV-PEG3和T-sTRAIL質(zhì)粒，利用設(shè)計(jì)的BamHI和HindⅢ位點(diǎn)，將sTRAIL基因連接入pAAV-PEG3后，得到pAAV-PEG3-sTRAIL質(zhì)粒。

1.7 pAAV-PEG3-sTRAIL質(zhì)粒的傳染

轉(zhuǎn)染前的準(zhǔn)備：細(xì)胞培養(yǎng)在100 mm的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞長満后傳代至六孔板中。當(dāng)細(xì)胞長到約80%融合度時(shí)，開始進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。每個(gè)孔轉(zhuǎn)染2μg pAAV-PEG3-sTRAIL質(zhì)粒。

轉(zhuǎn)染：2μg pAAV-PEG3-sTRAIL質(zhì)粒稀釋到100μL不含血清和抗菌素的DMEM中，輕輕混勻；6μL FEGENE HD稀釋于100μL不含血清和抗菌素的DMEM中，輕輕混勻；將100μL FEGENE HD稀釋液滴加到pAAV-PEG3-sTRAIL質(zhì)粒稀釋液中，一邊滴加一邊混勻。室溫孵育15～20 min；然后，將此 200μL FEGENE HD/pAAV-PEG3-sTRAI混合物加到每孔中，輕輕搖動(dòng)使混合均勻；放置于37℃，5%二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育24～48 h后，分析轉(zhuǎn)染目的基因的表達(dá)情況。

1.8 細(xì)胞早期凋亡的檢測

hSF、hES和 NTERA-2細(xì)胞轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pAAV-PEG3-sTRAIL或空載體pAAV-PEG348 h，0.5%胰酶消化，消化的細(xì)胞用1×PBS洗2次，再取PBS清洗過的5×105細(xì)胞1000 rpm離心5 min，去上清；加入400μL 1×結(jié)合緩沖液，混勻，取195μL于另一個(gè)Eppendorf管中，加入5 mL rh Annexin V/FITC抗體，室溫避光靜置 10 min；500μL l×結(jié)合緩沖液洗2次，1000 r/min離心5 min；去上清，加入190μL結(jié)合緩沖液，再加入10 μL PI，室溫避光靜置10 min后，F(xiàn)ACS檢測（4℃條件下可保存24 h）。

2 結(jié)果

2.1 PEG3啟動(dòng)子和sTRAIL基因的擴(kuò)增

電泳結(jié)果表明，本文成功地獲得了長度為301bp的PEG3啟動(dòng)子 DNA和長度為 519bp的sTRAIL DNA，其電泳條帶與預(yù)測的PEG3啟動(dòng)子（圖1）及sTRAIL基因（圖2）大小相符。為了進(jìn)一步檢測所擴(kuò)增的電泳條帶是否為所需要的目的產(chǎn)物，將目的電泳條帶進(jìn)行膠回收，并在插入T載體后進(jìn)行測序分析。結(jié)果證明無突變存在，接頭正確。

2.2 pAAV-PEG3-sTRAIL質(zhì)粒的酶切鑒定

圖1 PEG3啟動(dòng)子的擴(kuò)增結(jié)果

圖2 sTRAIL基因的擴(kuò)增結(jié)果

將構(gòu)建好的pAAV-PEG3-sTRAIL質(zhì)粒轉(zhuǎn)化擴(kuò)增及質(zhì)粒抽提后，以 kpnI、BamHI或 BamHI、HindⅢ進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定。結(jié)果顯示，有長度為301bp或519bp的特異性電泳條帶（圖3），符合PEG3啟動(dòng)子及sTRAIL基因的分子量大小。

圖3 pAAV-PEG3-sTRAIL質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果

2.3 sTRAIL114-281的表達(dá)

hSF、hES和 NTERA-2細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染AAV-PEG3-sTRAIL質(zhì)粒后，其sTRAIL的表達(dá)比轉(zhuǎn)染pAAV-PEG3空載體有明顯的上升，結(jié)果見圖4。此結(jié)果從分子水平證明，NTERA-2細(xì)胞的凋亡是sTRAIL高表達(dá)所引起的。

2.4 細(xì)胞早期凋亡的檢測

圖4 sTRAIL114-281基因半定量PCR檢測結(jié)果

為了檢測sTRAIL基因在PEG3啟動(dòng)子作用下是否能引起hSF、hES和NTERA-2細(xì)胞凋亡，本文用pAAV-PEG3-sTRAIL質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染hSF、hES和NTERA-2細(xì)胞，同時(shí)設(shè)立pAAV-PEG3空載體轉(zhuǎn)染對照組。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染48 h后，用rh Annexin V/FITC早期凋亡檢測試劑盒對轉(zhuǎn)染組及對照組hSF、hES及NTERA-2細(xì)胞進(jìn)行早期凋亡檢測。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染組hSF、hES及NTERA-2細(xì)胞早期凋亡率分別為（4.3±1.5）%、（2.3±1.2）%及（24.4±2.1）%，對照組hSF，hES、及 NTERA-2細(xì)胞早期凋亡率分別為（3.9%±1.3）%、（1.8%±0.9）%及（1.9%±1.2）%，結(jié)果見圖5。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果表明，sTRAIL基因在PEG3啟動(dòng)子啟動(dòng)下，能引起NTERA-2細(xì)胞凋亡，具有體外抑制NTERA-2細(xì)胞生長的能力，而對hES和hSF無細(xì)胞毒作用。

圖5 hSF、hES和NTERA-2細(xì)胞早期凋亡的流式細(xì)胞儀檢測

3 討論

在腫瘤的基因治療過程中，非腫瘤細(xì)胞特異性的轉(zhuǎn)基因表達(dá)，在殺死腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，也將殺死大量正常組織的細(xì)胞[8]。如能使促進(jìn)細(xì)胞凋亡的基因在腫瘤細(xì)胞中特異性的高表達(dá)，對于發(fā)展有效的腫瘤基因治療至關(guān)重要。為解決腫瘤基因治療中的細(xì)胞靶向性問題，人們把目光投向了組織特異性表達(dá)的啟動(dòng)子，希望腫瘤細(xì)胞特異性表達(dá)的啟動(dòng)子，能在腫瘤細(xì)胞中啟動(dòng)抑癌基因高表達(dá)，即可殺死腫瘤細(xì)胞，而對正常的組織又無細(xì)胞毒作用。SU等[9]證實(shí)，聯(lián)合運(yùn)用PEG3啟動(dòng)子和白介素-24能確保有效地、選擇性地殺傷腫瘤細(xì)胞，而正常組織細(xì)胞沒有發(fā)現(xiàn)可檢測到的細(xì)胞毒作用。SARKAR等[10]研究表明，用PEG3啟動(dòng)子啟動(dòng)白介素-24的表達(dá)，能明顯的抑制乳腺癌細(xì)胞和Du-145-Bcl-x（L）細(xì)胞的生長，并對原發(fā)性腫瘤和轉(zhuǎn)移性腫瘤具有很強(qiáng)的抑制作用，部分荷瘤小鼠甚至得到根治。因此，選擇PEG3作為啟動(dòng)sTRAIL基因表達(dá)的啟動(dòng)子，將有助于sTRAIL基因在腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，并通過選擇性地殺傷腫瘤細(xì)胞，達(dá)到抑瘤的目的。

在sTRAIL進(jìn)行的腫瘤基因治療中，人們首要考慮的問題就是sTRAIL的安全性。研究表明，sTRAIL能通過激活其死亡受體DR4和DR5引起大部分的腫瘤細(xì)胞凋亡，而對正常組織的細(xì)胞并無損傷[11-13]。近來研究證實(shí)，連續(xù)使用重組的、具有生物學(xué)活性的sTRAIL，在體外能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。動(dòng)物試驗(yàn)證明，sTRAIL在體內(nèi)能抑制腫瘤生長，改善荷瘤小鼠的生存狀態(tài)，延長實(shí)驗(yàn)小鼠的生存期[11-14]。更為重要的是，sTRAIL與放線菌素D、順鉑、喜樹堿等放療或化療藥物聯(lián)合使用，能增強(qiáng)sTRAIL對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，并能使對sTRAIL耐受的腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，抑制惡性轉(zhuǎn)移性腫瘤的發(fā)展[15]。sTRAIL正是因?yàn)樵诨蛑委熤械陌踩院陀行?，而被認(rèn)為是最有希望的抗腫瘤分子武器。

在本研究中，我們構(gòu)建了pAAV-PEG3-sTRAIL質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染hSF、hES和NTERA-2細(xì)胞，并運(yùn)用半定量PCR和流式細(xì)胞儀進(jìn)行sTRAIL基因的表達(dá)和細(xì)胞早期凋亡分析。結(jié)果表明，sTRAIL基因在PEG3啟動(dòng)子啟動(dòng)下，能選擇性地殺死具有腫瘤干細(xì)胞特性的NTERA-2細(xì)胞，而對正常組織細(xì)胞及干細(xì)胞無細(xì)胞毒作用，這將為腫瘤的基因治療甚至腫瘤干細(xì)胞的基因治療提供新的思路。

[1]TO DARO M,PEREZALEA M,SCOPELLITIA,etal.IL-4-mediated drug resistancein colon in cancer stem cells[J].Cell Cycle，2008,7(3):309-313.

[2]ERAMO A,LOTTI F,SETTE G,et al.Identification andexpansion of the tumorigenic lung cancer stem cell population[J]. Cell Death Differ,2008，15(3):504-514.

[3]PAL R,RAVINDRAN G.Assessment of pluripotency and multilineage differentiation potential of NTERA-2 cells as a model for studying human embryonic stem cells[J].Cell Prolif，2006，39(6)：585-598.

[4]WILEY SR,SCHOOLEY K.Death recepters as targets of cancer and characterization of a new member of the TNF family that induces apoptosis[J].Immunity,1995;3:673-82.

[5]SCHNEIDER P,TSCHOPP J.Apoptosis induced by death receptors[J].Pharm Acta Helv,2000;74:281-286.

[6]MARIANI SM,MATIBA B,ARMANDOLA EA,et al.Interleukin 1 beta-converting enzyme related proteases/caspases are involved in TRAIL-induced apoptosis of myeloma and leukemia cells[J].J Cell Biol,1997,137:221-229.

[7]ASHKENAZI A,PAI RC,FONG S,et al.Safety and antitumor activity of recombinant soluble Apo2 ligand[J].J Clin Invest,1999,104:155-162.

[8]SUN WJ,ZHANG YD.Progress of gene therapy for pancreatic carcinoma.China Journal of Modern Medicine,2006,16(15):2314-2318.Chinese

[9]SU ZZ,SARKAR D,EMDAD L,et al.Targeting gene expression selectively in cancer cells by using the progression-elevated gene-3 promoter[J].Proc Natl Acad Sci,2005,25:1059-1064.

[10]SARKAR D,LEBEDEVA IV,SU ZZ,et al. Eradication of therapy-resistant human prostate tumors using a cancer terminator virus[J].Cancer Res,2007,67:5434-5442.

[11]ASHKENAZI A,PAI RC,FONG S,et al.Safety and antitumor activity of recombinant soluble Apo2 ligand[J].J Clin Invest,1999,104:155-162.

[12]WALCZAK H,MILLER RE,ARIAIL K,et al.Activity of tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand in vivo[J].Nat Med,1999,5:157-163.

[13]CHINNAIYAN AM,PRASAD U,SHANKAR S,et al.Combined effect of tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand and ionizing radiation in breast cancer therapy[J].Proc Natl A-cad Sci,2000,97:1754-1759.

[14]ROTH W,ISENMANN S,NAUMANN U,et al.Locoregional Apo2L/TRAIL eradicates intracranial human malignant glioma xenografts in athymic mice in the absence of neurotoxicity[J].Biochem Biophys Res Commun,1999,265:479-483.

[15]ISHII M,IWAI M,HARADA Y,et al.Soluble TRAIL gene and actinomycin D synergistically suppressed multiple metastasis of TRAIL-resistant colon cancer in the liver[J].Cancer Letters,2006,1:1-10.