孫相民

頸痛膠囊由三七、川芎、延胡索、白芍、威靈仙、葛根、羌活七味藥組成，具活血化瘀、行氣止痛作用。用于神經(jīng)根型頸椎病屬血瘀氣滯、脈絡(luò)閉阻證。癥狀:頸、肩或上肢疼痛，發(fā)僵或竄麻、竄痛等。為了有效地控制本品質(zhì)量，對(duì)延胡索、川芎、白芍、葛根進(jìn)行了薄層鑒別，采用高效液相色譜法對(duì)三七中人參皂苷Rg1進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果滿意。

1 材料

1.1 儀器 AE135型電子分析天平(瑞士METTLER)，SSI型高效液相色譜儀，Lab Alliance泵(天津市蘭博實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備有限公司)，C18(250 mm×4.6 mm，5μm)色譜柱 (大連依利特科學(xué)儀器有限公司)，硅膠G薄層板(青島海洋化工廠)。

1.2 試劑 人參皂苷Rg1對(duì)照品(供含量測(cè)定用，中國藥品生物制品檢定所，批號(hào):10703-200810);延胡索對(duì)照藥材、延胡索乙素對(duì)照品、川芎對(duì)照藥材、芍藥苷對(duì)照品、葛根素對(duì)照品(中國藥品生物制品檢定所);頸痛膠囊(自制);陰性對(duì)照品(自制);乙腈為色譜純;水為純化水;其余所用試劑均為分析純。

2 方法

2.1 定性分析

2.1.1 延胡索TLC鑒別 取本品內(nèi)容物4 g，加乙醇50 ml，加熱回流1 h，放冷，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0 ml使溶解，加濃氨試液調(diào)至堿性，用乙醚提取2次，20 ml/次，合并乙醚液，揮干，殘?jiān)訜o水乙醇1 ml使溶解，作為供試品溶液。另取延胡索對(duì)照藥材1 g，同法制成對(duì)照藥材溶液;再取延胡索乙素對(duì)照品，加無水乙醇制成1 mg/ml的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法(附錄VI B)試驗(yàn)，吸取上述三種溶液各5 μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以正已烷-氯仿-甲醇(7.5∶4∶0.4)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以稀碘化鉍鉀試液。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材和對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。見圖1。

2.1.2 川芎TLC鑒別 取本品內(nèi)容物4 g，加乙醇20 ml，加熱回流1 h，放冷，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)訜o水乙醇2 ml使溶解，作為供試品溶液。另取川芎對(duì)照藥材1 g，加乙醚10 ml，超聲處理10 min，濾過，取濾液作為對(duì)照藥材溶液。照薄層色譜法(錄VI B)試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各5 μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以正已烷-醋酸乙酯(9∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。見圖2。

圖1 延胡索TLC色譜圖

圖2 川芎TLC色譜圖

2.1.3 白芍TLC鑒別 取2.1.2項(xiàng)下供試品溶液作為供試品溶液。另取芍藥苷對(duì)照品，加無水乙醇制成2 mg/ml的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法(附錄VI B)試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以氯仿-醋酸乙酯-甲醇-甲酸(40∶5:∶0∶0.2)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，熱風(fēng)吹至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。見圖3。

圖3 白芍TLC色譜圖

圖4 葛根TLC色譜圖

2.1.4 葛根TLC鑒別 取2.1.2項(xiàng)下供試品溶液作為供試品溶液。另取葛根素對(duì)照品，加無水乙醇制成1 mg/ml的溶液作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法(附錄VI B)試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各5 μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以氯仿-甲醇-水(7∶2.5∶0.2)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(365nm)下檢視。供試品色譜中在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。見圖4。

2.2 定量分析

2.2.1 色譜條件 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑;以乙腈-0.05%磷酸溶液(20∶80)為流動(dòng)相;檢測(cè)波長為203nm;柱溫40℃;流速1.5 ml/min。理論板數(shù)按人參皂苷Rg1峰計(jì)算應(yīng)不低于2500。

2.2.2 溶液的配制 對(duì)照品溶液的制備精密稱取人參皂苷Rg1適量，加乙腈-水(2:8)溶液制成每1 ml含人參皂苷Rg10.5 mg的溶液，即得;供試品溶液的制備取本品內(nèi)容物約0.8 g，精密稱定，置索氏提取器中，加乙醚100 ml，加熱回流3 h，棄去乙醚液，藥渣揮去乙醚，連同濾紙筒移入錐形瓶中，精密加入水飽和的正丁醇溶液50 ml，密塞，稱定重量，超聲處理30 min，放冷，再稱定重量，濾過，精密量取續(xù)濾液25 ml，水浴 蒸干，殘?jiān)右译?水(2∶8)溶液溶解，并定容至5 ml，濾過， 取續(xù)濾液即得;陰性對(duì)照溶液的制備按處方比例制備不含三 七的陰性對(duì)照品，按供試品溶液制備方法制備。以上3種溶 液按上述色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定。結(jié)果陰性對(duì)照在人參皂苷Rg1峰相應(yīng)的保留時(shí)間處無干擾。

2.2.3 線性關(guān)系考察 精密稱取人參皂苷Rg1對(duì)照品20 mg(20.14 ml)，置10 ml量瓶中，加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻 度，再分別精密移取 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 ml各置 5 ml量瓶 中，以流動(dòng)相稀釋至刻度，作為對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣20ul，測(cè) 定峰面積，記錄色譜圖，以峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)， 得回歸方程為:Y=2194415.1，x=21894.8，r=0.9995，表明 人參皂苷Rg1在4.028～20.14 μg之間呈良好的線性關(guān)系。

2.2.4 精密度試驗(yàn) 精密吸取濃度為0.481 mg/ml對(duì)照品 溶液，在相同的色譜條件下，重復(fù)進(jìn)樣6次，按上述色譜條件 測(cè)定，人參皂苷Rg1峰面積的RSD為0.64%。

圖5 人參皂苷Rg1對(duì)照品HPLC色譜圖

圖6 頸痛膠囊樣品HPLC色譜圖

圖7 陰性樣品HPLC色譜圖

2.2.5 重現(xiàn)性試驗(yàn) 精密稱取同一批樣品6份，按供試品溶液制備方法制備，在相同色譜條件下進(jìn)樣，考察方法的重現(xiàn)性，RSD為1.02%。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，分別在制備后0、1、2、3、4、6 h，按上述色譜條件，測(cè)定其含量，RSD 為 1.25%。結(jié)果表明，供試品溶液在6 h內(nèi)穩(wěn)定，測(cè)定結(jié)果無顯著變化。

2.2.7 回收率試驗(yàn) 取已知含量的頸痛膠囊樣品0.4 g，加入人參皂苷Rg1對(duì)照品約3.4 mg。按供試品溶液制備項(xiàng)下方法處理，測(cè)定。

表1 人參皂苷Rg1加樣回收率測(cè)定結(jié)果(n=6)

2.2.8 樣品測(cè)定 取本品內(nèi)容物約0.8 g，精密稱定，置索氏提取器中，加乙醚100 ml，加熱回流3 h，棄去乙醚液，藥渣揮去乙醚，連同濾紙筒移入錐形瓶中，精密加入水飽和的正丁醇溶液50 ml，密塞，稱定重量，超聲處理30 min，放冷，再稱定重量，濾過，精密量取續(xù)濾液25 ml，水浴蒸干，殘?jiān)右译?水(2∶8)溶液溶解，并定容至 5 ml，濾過，取 20 μl進(jìn)樣，測(cè)定。

表2 人參皂苷Rg1含量測(cè)定結(jié)果(n=3)

3 討論

3.1 本品薄層色譜鑒別做了陰性對(duì)照試驗(yàn)，結(jié)果表明薄層斑點(diǎn)不受樣品中其他各藥的干擾，專屬性強(qiáng)，簡(jiǎn)單易行，可作為本品定性檢測(cè)的指標(biāo)。

3.2 原制劑頸痛顆粒［1］標(biāo)準(zhǔn)采用薄層掃描法測(cè)定三七中人參皂苷Rg1的含量，實(shí)際工作中發(fā)現(xiàn)該方法受環(huán)境影響較大，實(shí)驗(yàn)誤差大，且操作繁瑣。現(xiàn)參照中國藥典2005年版一部［2］人參項(xiàng)下的含量測(cè)定方法，改為高效液相色譜法測(cè)定三七中人參皂苷Rg1的含量，方法簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確性高。

3.3 含量測(cè)定中選擇色譜條件時(shí)，曾對(duì)流動(dòng)相包括溶劑系統(tǒng)的組成和比例進(jìn)行了探索，根據(jù)參考文獻(xiàn)對(duì)多種溶劑系統(tǒng)進(jìn)行了選擇:①甲醇-水(25∶75);②甲醇-8%醋酸溶液(30∶70);③乙腈-水(20∶80);④乙腈-水-冰醋酸(20∶80∶1)。根據(jù)分離情況，最后選擇乙腈-水(20∶80)為流動(dòng)相，流速1.5 ml/min。

3.4 作者曾對(duì)樣品提取方法進(jìn)行了考察，分別采用乙醚和氯仿進(jìn)行了脫酯試驗(yàn)，結(jié)果氯仿脫脂，干擾成分較多，分離效果不如乙醚脫脂效果好，故選擇乙醚作為脫脂溶劑。樣品經(jīng)脫酯后分別采用水飽和的正丁醇溶液、甲醇溶液回流和超聲2種提取方法，經(jīng)測(cè)定，超聲和回流含量相近，故采用本文中的提取方法。通過測(cè)定本品中人參皂苷Rg1的含量，3批產(chǎn)品含量穩(wěn)定，平均每粒膠囊含人參皂苷Rg14.30 mg，人參皂苷Rg1的含量＞3.8 mg。

［1］中華人民共和國藥典.化學(xué)工業(yè)出版社，2005，10.

［2］國家藥典委員會(huì).國家藥品標(biāo)準(zhǔn)，2004，43:13-14.