陳 芳 黃京平 王 鵬 張金振 趙 靜 李 熠

（中國(guó)農(nóng)科院蜜蜂研究所，國(guó)家農(nóng)產(chǎn)品加工中心蜂業(yè)分中心，北京100093）

1 前言

蜂蜜是蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露與自身分泌物結(jié)合后，經(jīng)過在巢脾內(nèi)轉(zhuǎn)化、脫水、貯存至成熟的天然甜物質(zhì)[1]。蜂蜜因具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值深受人們喜愛。近年來，隨著人民生活水平的提高和保健意識(shí)的增強(qiáng)，國(guó)內(nèi)消費(fèi)市場(chǎng)也在日益增大，蜂蜜真實(shí)性已成為政府重視、社會(huì)關(guān)注和人民關(guān)心的熱點(diǎn)問題，也是困擾行業(yè)發(fā)展的關(guān)鍵問題。

行業(yè)自律是維護(hù)蜂蜜真實(shí)性的根本之道，但與時(shí)俱進(jìn)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)及檢測(cè)技術(shù)是保障蜂蜜真實(shí)性的不可或缺的有力砝碼。國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局頒布的《蜂蜜中碳-4植物糖含量測(cè)定方法穩(wěn)定碳同位素比率法》(GB/T18932.1-2002)和2005年頒布的強(qiáng)制性國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《蜂蜜》（GB18796-2005），對(duì)保障蜂蜜真實(shí)性和維護(hù)蜂產(chǎn)品行業(yè)及市場(chǎng)秩序都產(chǎn)生了積極的作用。但隨著造假技術(shù)的不斷深入，單一的檢測(cè)技術(shù)及評(píng)判指標(biāo)已不適應(yīng)維護(hù)蜂蜜真實(shí)性的需求，需要認(rèn)真地調(diào)查我國(guó)市場(chǎng)蜂蜜產(chǎn)品的現(xiàn)狀，分析研究各項(xiàng)基礎(chǔ)數(shù)據(jù)以提供科學(xué)有效的應(yīng)對(duì)技術(shù)。

本研究從全國(guó)17個(gè)主要蜂蜜產(chǎn)區(qū)的代表城市抽取相當(dāng)數(shù)量的蜂蜜樣品，通過液相色譜、穩(wěn)定同位素質(zhì)譜等先進(jìn)的儀器分析蜂蜜中的果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖（以下簡(jiǎn)稱蜂蜜四糖）及碳同位素比值。描述分析數(shù)據(jù)的基本情況及可能的真實(shí)性現(xiàn)狀，并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，包括描述性分析、獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)及因子分析（主成分分析）等，提煉出更為科學(xué)合理的真實(shí)性評(píng)價(jià)指標(biāo)。

2 材料與方法

以下方法均采用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T18932.1-2002[2],GB/T18932.22-2003[3]。

2.1 材料與試劑

果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)于美國(guó)Sigma公司。橄欖油標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)于英國(guó)Elemental Microanalysis公司。乙腈（色譜級(jí)），鎢酸鈉、硫酸均為優(yōu)級(jí)純。流動(dòng)相用水為超純水，樣品前處理用水為去離子水。

2.2 儀器與設(shè)備

Waters2695液相色譜儀，2414示差檢測(cè)器；SerCon EA-Hydra20-20穩(wěn)定同位素比例色譜儀；Milli-Q超純水儀；恒溫水浴鍋；高速離心機(jī)。

2.3 樣品的采集

330個(gè)蜂蜜樣品采自十幾個(gè)省、市、自治區(qū)的市場(chǎng)或超市，具體情況如下：安徽省（19個(gè)）、北京市（79個(gè)）、福建省（8個(gè)）、廣東?。?0個(gè)）、廣西壯族自治區(qū)（17個(gè)）、河北?。?1個(gè)）、河南省（10個(gè)）、湖北省（23個(gè)）、江蘇省（16個(gè)）、江西省（13個(gè)）、遼寧?。?9個(gè)）、山東省（19個(gè)）、上海市（32個(gè)）、四川?。?1個(gè)）、天津市（7個(gè)）、浙江?。?6個(gè)）。

2.4 試劑及標(biāo)線配制

2.4.1 果糖、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：準(zhǔn)確稱取5g果糖標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和4g葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，精確至0.0001g，放入同一100ml容量瓶中，加入60ml水溶解，用乙腈定容至體積，搖勻。

2.4.2 蔗糖、麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：分別稱取2g蔗糖和2g麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，精確至0.0001g，放入同一100ml容量瓶中，加入60ml水溶解，用乙腈定容至體積，搖勻。

2.4.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：吸取不同體積的果糖、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液和蔗糖、麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，用乙腈+水（40+60）稀釋至體積，配成不同濃度的蜂蜜四糖標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，用于繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。如下表：

表1 繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線用的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度、用量

2.4.4 10%鎢酸鈉溶液：稱取10g鎢酸鈉，用水定容至100ml。

2.4.5 0.335mol/l硫酸溶液：移取9.4ml硫酸，用水定容至 500ml。

2.4.6 取1.0μl橄欖油標(biāo)準(zhǔn)品于8mm×5mm錫杯中，密封用于測(cè)定蛋白質(zhì)樣品；取2.0μl橄欖油標(biāo)準(zhǔn)品于8mm×5mm錫杯中，密封用于測(cè)定蜂蜜樣品。

2.5 樣品的制備

2.5.1 蜂蜜四糖樣品的制備：稱取5 g試樣，精確至0.001g。置于100 ml燒杯中，加入30 ml水，用玻璃棒攪拌使試樣完全溶解，轉(zhuǎn)移至100ml容量瓶中，然后再用3×10ml水洗燒杯并轉(zhuǎn)移至上述100ml容量瓶中，用乙腈定容至體積，混勻。用0.45μm濾膜將樣液過濾入樣品瓶中，用液相色譜-示差折光檢測(cè)器測(cè)定。

2.5.2 蜂蜜中C-4植物糖樣品的制備：稱取蜂蜜樣品10～12g于50ml離心管中，加入4ml水混勻，在一支20ml量筒中加入2.0ml10%鎢酸鈉溶液和2.0ml0.336mol/l硫酸溶液，迅速混勻后，加到上述盛蜂蜜樣品的離心管中，混勻。置于80℃水浴中加熱不少于30min，在加熱過程中，每隔5～10min旋轉(zhuǎn)混合離心管中內(nèi)容物20s，直到有絮狀物析出。

以水注滿離心管并混合，在RCF1500×g下離心5min，傾掉上層清液，再以約50ml水充分洗滌沉淀物并離心，如此反復(fù)洗滌沉淀物5次，最后刀桿上清液，將含有沉淀蛋白質(zhì)的離心管置于75℃烘箱中干燥3h以上,備用。

稱取上述烘干的蛋白質(zhì)3.0mg，于8mm×5mm錫杯中，密封備用；移取3.0μl蜂蜜樣品于8mm×5mm錫杯中，密封備用；蛋白質(zhì)及蜂蜜樣品均制備平行樣。

2.6 儀器參數(shù)及樣品測(cè)定

2.6.1 液相色譜條件：色譜柱：色譜柱為Carbohydrate(250mm×4μm×4.6 i.d)或相當(dāng)者；流動(dòng)相：乙腈+水（77+23）；流速：1.0 ml/min；柱溫：30℃；檢測(cè)器池溫度：35℃；進(jìn)樣量：15 μl。

2.6.2 穩(wěn)定同位素比例色譜儀條件：載氣：氦氣（99.999%）；助燃?xì)猓貉鯕猓?9.999%）；燃燒爐溫度：1000℃；反應(yīng)爐：600℃；色譜柱溫度：70℃。

2.7 數(shù)據(jù)分析

蜂蜜四糖及C-4植物糖均參見國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中的結(jié)果計(jì)算方法計(jì)算結(jié)果。所有數(shù)據(jù)均采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，包括描述性分析、獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)、因子分析（主成分分析）等。

3 結(jié)果與討論

3.1 市場(chǎng)蜂蜜真實(shí)性現(xiàn)狀

以國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的果糖、葡萄糖之和（即還原糖含量）大于60%，蔗糖含量低于5%，C-4植物糖含量小于或等于7%為合格計(jì)，共有83個(gè)樣品不合格，其中18個(gè)是還原糖含量和C-4植物糖均不合格，6個(gè)還原糖含量不合格，但C-4植物糖含量卻合格，59個(gè)還原糖含量合格但C-4植物糖不合格，無(wú)蔗糖不合格樣品。

由此可推見我國(guó)目前蜂蜜市場(chǎng)現(xiàn)狀大致可歸納為以下幾點(diǎn)：1.產(chǎn)品合格率低，僅為74.8%；C-4植物糖不合格是蜂蜜樣品不合格的主要表現(xiàn)形式，C-4不合格率占總不合格樣品的92.8%。2.還原糖不合格的樣品僅為很小一部分，無(wú)蔗糖不合格樣品。3.市場(chǎng)的不合格樣品中以摻假居多，完全造假行為（即以無(wú)蛋白析出樣品計(jì)）較少，僅占總樣品量的1.81%。4.市場(chǎng)出現(xiàn)了很大一部分以非C-4植物糖為原料的摻假蜂蜜，現(xiàn)有的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)無(wú)法約束。目前我國(guó)現(xiàn)行的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)是用穩(wěn)定同位素質(zhì)譜法測(cè)定蜂蜜中C-4植物糖含量，因此只能計(jì)算出添加的C-4植物糖含量，不能約束非C-4植物糖的添加物。而國(guó)際通用的ISCIRA指數(shù)是指δ13CH與δ13CP的差值的絕對(duì)值小于1，表明的是純天然蜂蜜δ13CH與δ13CP的離散程度，可以在一定程度上對(duì)非蜂蜜添加物進(jìn)行約束。因此以ISCIRA指數(shù)計(jì)，不合格數(shù)為132個(gè)，且這132個(gè)不合格樣品中涵蓋了所有還原糖不合格樣品。由此可見，ISCIRA指數(shù)對(duì)目前我國(guó)蜂蜜市場(chǎng)上出現(xiàn)了很大一部分非C-4植物糖摻假的蜂蜜樣品，具有一定的約束力。

3.2 蜂蜜樣品產(chǎn)品指標(biāo)的統(tǒng)計(jì)分析

雖然，目前我們已經(jīng)運(yùn)用了先進(jìn)的儀器設(shè)備和檢測(cè)技術(shù)對(duì)蜂蜜質(zhì)量進(jìn)行監(jiān)管，但由于巨大的商業(yè)潛力及造假技術(shù)的不斷深入，單一的檢測(cè)技術(shù)及判定指標(biāo)很難對(duì)蜂蜜真實(shí)性進(jìn)行鑒別，因此我們應(yīng)該提取更多的判定指標(biāo)，對(duì)蜂蜜的真實(shí)性進(jìn)行更為嚴(yán)格的限定，以保障蜂蜜市場(chǎng)的有序。根據(jù)上述現(xiàn)狀，以果糖、葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、還原糖、果葡比、δ13CH、δ13CP、ISCIRA 指數(shù)等 9 個(gè)指標(biāo)為統(tǒng)計(jì)對(duì)象，重點(diǎn)研究不合格與合格樣品各項(xiàng)指標(biāo)的差異及合格樣品可能的代表性指標(biāo)。探索性描述分析結(jié)果表明（見圖1），合格樣品組較不合格樣品組具有各個(gè)指標(biāo)的分布范圍更集中，且符合更好的正態(tài)分布模型等特征。獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，果糖、葡萄糖、麥芽糖、δ13CH值和δ13CP值組間平均值差異顯著，蔗糖組間均值差異不顯著。合格組的果糖、葡萄糖平均值顯著高于不合格組，麥芽糖、δ13CH、δ13CP值顯著低于不合格組均值，合格組δ13CH、δ13CP均值分別為-24.14‰和-24.16‰，低于-23.5‰（目前認(rèn)為的摻假界限[4]），而不合格組 δ13CH、δ13CP的均值分別為-22.20‰和-22.84‰，高于-23.5‰。

圖1 合格樣品與不合格樣品8項(xiàng)指標(biāo)正態(tài)分布圖差異比較

對(duì)合格樣品及不合格樣品的因子分析得出的統(tǒng)計(jì)模型（圖2）發(fā)現(xiàn)，不合格樣品提取出了3個(gè)公因子，分別為還原糖含量、ISCIRA指數(shù)及C-4植物糖含量。代表了用于描述不合格蜂蜜樣品性狀的指標(biāo)僅為糖的含量、蜂蜜與蜂蜜蛋白質(zhì)碳同位素比值的接近程度和C-4植物糖含量?，F(xiàn)行國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中對(duì)蜂蜜中還原糖含量及C-4植物糖含量已經(jīng)有了標(biāo)準(zhǔn)限定，但這兩項(xiàng)指標(biāo)對(duì)目前市場(chǎng)上出現(xiàn)的非C-4植物糖型的摻假行為不具備約束力，統(tǒng)計(jì)模型中第二公因子ISCIRA指數(shù)的提出證明了ISCIRA值更利于描述蜂蜜真實(shí)性，因?yàn)镮SCIRA指數(shù)所表達(dá)的意義已經(jīng)涵蓋并延伸了現(xiàn)行國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中C-4植物糖含量的規(guī)定。合格樣品提取出了4個(gè)公因子，分別為果葡比、還原糖含量、ISCIRA指數(shù)和δ13CP值，說明了用于描述合格樣品性狀的指標(biāo)應(yīng)包括蜂蜜中糖的構(gòu)成、糖的含量、蜂蜜與蜂蜜蛋白質(zhì)碳同位素比值的接近程度及蜂蜜蛋白值的同位素比值。在合格樣品和不合格樣品中均有提取到公因子還原糖含量和ISCIRA指數(shù)，但合格樣品多了果葡比和δ13CP值，其中δ13CP值因其穩(wěn)定及檢測(cè)效果好而被認(rèn)定為蜂蜜碳同位素比值測(cè)定法的內(nèi)標(biāo)物[5]。也就是說，即使糖的含量和蜂蜜與蜂蜜蛋白質(zhì)碳同位素比值的接近程度符合標(biāo)準(zhǔn)要求，也不一定表明是真實(shí)的蜂蜜樣品，還應(yīng)該對(duì)不同品種蜂蜜的果葡比及δ13CP值進(jìn)行深入的研究，給出合理的范圍，才有利于蜂蜜真實(shí)性及品質(zhì)鑒別。

圖2 合格樣品(A)與不合格樣品(B)因子分析成分得分系數(shù)矩陣圖

4 展望

由于我國(guó)蜜源植物豐富，且地域遼闊，氣候、環(huán)境條件差異十分顯著，因此，不同地區(qū)、不同品種的蜂蜜樣品的糖的含量、構(gòu)成及δ13CP值將會(huì)有很大的差異。在未來的研究中，我們應(yīng)深入細(xì)致地調(diào)查蜂蜜品種、地域在糖的含量、構(gòu)成，δ13CP值和ISCIRA指數(shù)等指標(biāo)上的差異，給出合理的范圍值，細(xì)化標(biāo)準(zhǔn)，為蜂蜜質(zhì)量與品質(zhì)監(jiān)督檢驗(yàn)提供技術(shù)支持。

［1］中華人民共和國(guó)國(guó)標(biāo)GB18796－2005.

［2］中華人民共和國(guó)國(guó)標(biāo)《蜂蜜中碳-4植物糖含量測(cè)定方法穩(wěn)定碳同位素比率法》GB/T18932.1－2002.

［3］中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《蜂蜜中果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖測(cè)定方法液相色譜法》GB/T18932.22-2003.

［4］朱青，王畢妮，梁艷，陳衛(wèi)軍，曹煒.蜂蜜摻假檢測(cè)方法的研究進(jìn)展[J].中國(guó)蜂業(yè) 2008，59（10）：35-37.

［5］胡福良.碳穩(wěn)定同位素比值分析法(SIRA)在蜂蜜質(zhì)量鑒別中的應(yīng)用[J].中國(guó)養(yǎng)蜂 2000，51（6）：21-22.