宋明鳴,杜曉寧

(上?；ぱ芯吭?上海 200062)

S-芐基-L-半胱氨酸(SBC)是巰基保護(hù)的氨基酸,是肽類藥物谷胱甘肽合成中重要的前體[1]。SBC可通過進(jìn)一步酯化、Grignard反應(yīng)制得手性β-氨基醇,用作對(duì)潛手性酮進(jìn)行不對(duì)稱還原反應(yīng)的手性配體[2]。15N是氮元素的穩(wěn)定同位素,作為示蹤劑廣泛應(yīng)用于生物化學(xué)、醫(yī)學(xué)、藥物學(xué)、農(nóng)業(yè)科學(xué)等領(lǐng)域。15N標(biāo)記氨基酸和多肽是研究醫(yī)學(xué)和生命科學(xué)的重要工具,在蛋白質(zhì)的人工合成、判定生物活性物質(zhì)(多肽、蛋白質(zhì))的化學(xué)結(jié)構(gòu)及藥用機(jī)理等領(lǐng)域都發(fā)揮著獨(dú)特的示蹤作用[3]。天然豐度半胱氨酸類化合物的分析檢測(cè)主要是采用高效液相色譜法(HPLC),其基本原理是利用該類化合物中的氨基與一系列衍生試劑反應(yīng),通過色譜柱分離后進(jìn)行測(cè)定[4]。但該方法分析檢測(cè)時(shí)間過長(zhǎng),不利于對(duì)SBC樣品合成過程進(jìn)行實(shí)時(shí)快速檢測(cè)。本研究擬對(duì)HPLC方法進(jìn)行改進(jìn),建立一種新的簡(jiǎn)便快捷的檢測(cè)方法。

1 主要儀器與試劑

2487型高效液相色譜儀:美國(guó)Waters公司產(chǎn)品,配備1525型兩元梯度泵,2487型紫外可見雙波長(zhǎng)檢測(cè)器,Breeze色譜數(shù)據(jù)工作站;756MC紫外可見分光光度計(jì):上海分析儀器二廠產(chǎn)品;MAT-271氣體同位素質(zhì)譜計(jì):美國(guó)Finnigan質(zhì)譜公司;高溫電阻爐(又稱馬弗爐):上海實(shí)驗(yàn)儀器廠;真空轉(zhuǎn)化系統(tǒng):系統(tǒng)真空度高于10-2Pa,本實(shí)驗(yàn)室自制[5]。

SBC標(biāo)準(zhǔn)品:純度99%,ACROS公司產(chǎn)品;乙腈:色譜純,上海強(qiáng)順化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品;N,N-二甲基甲酰胺:分析純,上海凌峰化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品;2,4-二硝基氟苯(DNFB)、碳酸氫鈉:分析純,中國(guó)醫(yī)藥上?；瘜W(xué)試劑有限公司產(chǎn)品;氧化銅、氧化鈣、5A分子篩、銅絲均為國(guó)產(chǎn)試劑。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 SBC含量的測(cè)定

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)品的配制、衍生及含量測(cè)定

準(zhǔn)確稱取100 mg SBC標(biāo)準(zhǔn)品于100 mL容量瓶中,再加入5 mL 6 mol/L鹽酸溶液,用水稀釋至刻度,作為儲(chǔ)備標(biāo)準(zhǔn)品溶液備用。

移取1 mL配制好的儲(chǔ)備標(biāo)準(zhǔn)品溶液至10 mL容量瓶中,再加入2 mL 0.2 mol/L碳酸氫鈉溶液和1 mL 1%DNFB乙腈溶液,在60℃水浴中避光反應(yīng)1 h,冷卻至室溫,用0.2 mol/L p H 7.0磷酸鹽緩沖溶液稀釋至刻度,搖勻。以4 000 r/min離心10 min,再用0.45μm濾膜過濾,得到標(biāo)準(zhǔn)品衍生溶液。用HPLC對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品衍生溶液進(jìn)行分析。分析條件:色譜柱為Cosmosil C18柱(5μm,150 mm×4.6 mm);流動(dòng)相A為0.05 mol/L乙酸鈉緩沖溶液(pH=6.5,含10 mL/L N,N-二甲基甲酰胺);流動(dòng)相B為V(乙腈)∶V(水)=3∶1。流動(dòng)相B的梯度洗脫程序如下:0 min,75%;10 min,40%;13 min,5%;17 min,75%;流動(dòng)相流速為1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)為350 nm;柱溫為 30℃;進(jìn)樣量為5μL。

2.1.2 樣品的衍生及含量測(cè)定

移取適量15N標(biāo)記SBC的發(fā)酵液至10 mL容量瓶中,再加入2 mL 0.2 mol/L碳酸氫鈉溶液和1 mL 1%DNFB乙腈溶液,60℃水浴中避光反應(yīng)1 h,冷卻至室溫,用0.2 mol/L磷酸鹽緩沖溶液稀釋至刻度,搖勻。以4 000 r/min離心10 min,再用0.45μm濾膜過濾,得到待測(cè)樣品的衍生溶液。對(duì)樣品衍生溶液進(jìn)行HPLC分析。分析條件與2.1.1節(jié)相同。

2.2 同位素15N豐度的測(cè)定

2.2.1 樣品處理

采用微量高溫燃燒法[6]轉(zhuǎn)化SBC樣品:稱取適量SBC標(biāo)準(zhǔn)品,與還原劑氧化銅、吸附劑氧化鈣、5A分子篩和銅絲一同加入樣品轉(zhuǎn)化管中[7],接入真空轉(zhuǎn)化系統(tǒng),在真空度高于0.05 Pa時(shí)將轉(zhuǎn)化管熔封,放入馬弗爐中,高溫下反應(yīng)數(shù)小時(shí)后取出,自然冷卻備用。

2.2.2 樣品的測(cè)定

用氣體同位素MAT-271質(zhì)譜計(jì)測(cè)定處理后的樣品中15N的豐度。

3 結(jié)果與討論

3.1 SBC含量的測(cè)定

3.1.1 分離條件的選擇

(1)檢測(cè)波長(zhǎng)。對(duì)SBC標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行波長(zhǎng)全掃描,發(fā)現(xiàn)在檢測(cè)波長(zhǎng)為200～400 nm區(qū)間內(nèi)有最大吸收。分別將波長(zhǎng)設(shè)定為200、250、300、350、400 nm 對(duì)樣品溶液進(jìn)行測(cè)定,從所得譜圖上看,λ=350 nm時(shí),SBC峰強(qiáng)度最大,且其余雜質(zhì)峰相對(duì)較小,對(duì)計(jì)算結(jié)果的干擾最小,故選擇350 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

(2)流動(dòng)相 p H。分別配制 p H=6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.0的流動(dòng)相進(jìn)行樣品溶液的測(cè)定,從譜圖上看,p H＜6.4時(shí),SBC與其它雜質(zhì)峰會(huì)產(chǎn)生部分重疊,無法實(shí)現(xiàn)有效分離,且所有峰的保留時(shí)間都較大。pH＞6.4時(shí),所有峰的拖尾現(xiàn)象都很嚴(yán)重,不利于組分的定量計(jì)算。通過實(shí)驗(yàn),流動(dòng)相 pH為6.4時(shí),分離效果最佳。pH=6.4時(shí)樣品的HPLC譜圖示于圖1。

圖1 SBC樣品HPLC譜圖(p H=6.4)

(3)柱溫。分別將柱溫設(shè)定為 20、25、30、35、40℃,對(duì)樣品溶液進(jìn)行 HPLC分析。從HPLC譜圖上看,柱溫對(duì)于SBC峰強(qiáng)度的影響不大;但隨著溫度的升高,SBC與其他雜質(zhì)峰的分離度越來越小,不利于分析結(jié)果的計(jì)算。同時(shí),柱溫越低,SBC及其他雜質(zhì)峰的保留時(shí)間越長(zhǎng),分析時(shí)間將大幅延長(zhǎng)。綜合考慮,取柱溫為30℃。

3.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢出限

分別配制 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g/L 的SBC標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,按2.1.1節(jié)的方法進(jìn)行HPLC分析,結(jié)果示于圖2。由圖2可以看出,在10 min以內(nèi)即可檢測(cè)到SBC的色譜峰,大幅節(jié)約了分析時(shí)間,有利于實(shí)現(xiàn)對(duì)反應(yīng)過程中SBC濃度的實(shí)時(shí)監(jiān)控。

以圖2中SBC峰的面積(y)對(duì)SBC溶液的濃度(x)作圖,得到SBC的標(biāo)準(zhǔn)曲線,結(jié)果示于圖3。對(duì)圖3進(jìn)行線性回歸分析,其回歸方程為y=3×106x-4.16×104,R2=0.998 6。此結(jié)果表明,SBC的濃度c在0.2～1.0 g/L范圍內(nèi)與其色譜峰面積A呈良好的線性關(guān)系。

圖2 SBC標(biāo)準(zhǔn)品HPLC譜圖

圖3 SBC標(biāo)準(zhǔn)曲線

檢出限的確定:取SBC標(biāo)準(zhǔn)品溶液適量,采用逐級(jí)稀釋法,按進(jìn)樣后所得譜圖中SBC峰信噪比約為3倍計(jì)算,得出該方法對(duì)于SBC溶液的檢測(cè)限為3.95×10-4g/L。

3.1.3 精密度實(shí)驗(yàn)

取5μL SBC標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行HPLC分析。重復(fù)進(jìn)樣6次,所得HPLC譜圖中SBC峰面積列于表1。由表1可以看出,測(cè)定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.45%。

表1 SBC精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1.4 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

在5批SBC含量為0.141 g/L的發(fā)酵液中分別加入等量的約1.0 g/L SBC標(biāo)準(zhǔn)品溶液,按前述方法衍生后進(jìn)行HPLC分析。加標(biāo)后SBC理論含量為0.570 g/L,實(shí)測(cè)含量分別為0.556、0.555、0.553、0.555 、0.554 g/L 。據(jù)此計(jì)算得加標(biāo)回收率分別為 97.5%、97.4%、97.0%、97.4%、97.2%,平均回收率為97.3%。

3.1.5 樣品中SBC含量測(cè)定

按照本實(shí)驗(yàn)方法對(duì)不同反應(yīng)時(shí)間得到的發(fā)酵液中SBC含量進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果示于圖4。從圖4可以看出,采用該發(fā)酵工藝合成SBC,反應(yīng)在很短的時(shí)間內(nèi)即可完成。隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng),SBC將繼續(xù)反應(yīng)生成其他產(chǎn)物,反而會(huì)降低其在發(fā)酵液中的含量。因此,采用該路線合成SBC時(shí),建議反應(yīng)1 h后即可進(jìn)行目標(biāo)產(chǎn)物的分離提取。

對(duì)于該發(fā)酵工藝合成SBC中的其他影響因素(反應(yīng)溫度、投料配比等),采用本實(shí)驗(yàn)方法也進(jìn)行了進(jìn)一步考察,均取得了滿意的結(jié)果。說明利用本研究建立的檢測(cè)方法,可為該發(fā)酵工藝合成SBC提供很好的指導(dǎo)作用。

圖4 反應(yīng)時(shí)間對(duì)SBC含量的影響

3.2 同位素15N豐度的測(cè)定

3.2.1 樣品的轉(zhuǎn)化處理?xiàng)l件

用高溫燃燒法[6,8]處理SBC樣品,針對(duì)反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、樣品量等做了相關(guān)實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示,SBC樣品的轉(zhuǎn)化溫度為530℃,反應(yīng)時(shí)間為3 h,稱樣量2 mg可以滿足質(zhì)譜檢測(cè)要求。

3.2.2 樣品管中雜質(zhì)氣體的影響

SBC屬巰基保護(hù)的氨基酸,分子中所含的硫在高溫燃燒過程中會(huì)生成少量的SO2、H2S等雜質(zhì)氣體,這些雜質(zhì)氣體是否會(huì)對(duì)樣品轉(zhuǎn)化產(chǎn)生影響未見相關(guān)報(bào)道,本實(shí)驗(yàn)利用普通SBC試劑對(duì)這一因素進(jìn)行了考察,結(jié)果列于表2。由表2可以看出,樣品中硫的存在對(duì)樣品轉(zhuǎn)化和15N豐度測(cè)定的精確度不會(huì)產(chǎn)生影響。采用微量高溫燃燒法轉(zhuǎn)化SBC樣品可以滿足氣體同位素質(zhì)譜測(cè)定15N同位素豐度的要求。

表2 雜質(zhì)氣體對(duì)15 N豐度的影響

4 結(jié) 論

1)采用本工作建立的HPLC法測(cè)定發(fā)酵液中SBC的含量,操作簡(jiǎn)便快捷,準(zhǔn)確度及精度高,數(shù)據(jù)重現(xiàn)性好。

2)采用本測(cè)定方法分析發(fā)酵液中SBC含量時(shí),檢測(cè)波長(zhǎng)、流動(dòng)相的pH、柱溫等因素均對(duì)測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性有影響。最佳分析條件為:檢測(cè)波長(zhǎng)350 nm,流動(dòng)相p H 6.4,柱溫 30℃。

3)采用微量高溫燃燒法進(jìn)行樣品轉(zhuǎn)化,氣體同位素質(zhì)譜計(jì)分析15N標(biāo)記SBC中15N的同位素。該方法具有測(cè)定消耗樣品量少,精確度高的優(yōu)點(diǎn),對(duì)于制備15N標(biāo)記SBC產(chǎn)品工藝優(yōu)化具有很好的指導(dǎo)作用。

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