劉屹嵩 魏 冰 閆征斌 王天祥 柳宏志

涎腺腫瘤是口腔頜面部的常見(jiàn)腫瘤,其發(fā)生、發(fā)展與腫瘤組織的血管形成及細(xì)胞的增殖活性密切相關(guān)。近期研究結(jié)果表明,5-脂氧合酶(5-LOX)可能通過(guò)多個(gè)途徑促進(jìn)腫瘤的發(fā)生,血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)是重要的促血管生成調(diào)節(jié)因子,在許多腫瘤組織尤其是惡性腫瘤中高度表達(dá)。然而迄今為止,有關(guān) 5-LOX在涎腺腫瘤中的表達(dá)和作用報(bào)道不多。本實(shí)驗(yàn)采用免疫組化方法,通過(guò)檢測(cè) 5-LOX和 VEGF在涎腺腫瘤的表達(dá)情況,探討它們?cè)谙严倌[瘤發(fā)生、發(fā)展中的重要作用。

1 資料與方法

1.1 資料

收集 2005年～2009年大慶油田總醫(yī)院口腔頜面外科手術(shù)切除的 60例涎腺腫瘤組織及 20例正常涎腺組織存檔標(biāo)本。其中男性 33例,女性 27例,年齡 18～64歲,平均年齡 41歲;其中良性腫瘤 32例,包括多形性腺瘤 18例,腺淋巴瘤 14例;惡性腫瘤 28例,包括惡性混合瘤 7例,腺樣囊性癌 12例,黏液表皮樣癌 9例;正常涎腺組織為因外傷致涎瘺而摘除腮腺組織 12例,腺淋巴瘤中遠(yuǎn)離瘤旁組織 8例?；颊咝g(shù)前均未行放療、化療,術(shù)后均有明確的病理學(xué)診斷。將涎腺腫瘤組織和正常涎腺組織置于 10%多聚甲醛液中固定,常規(guī)石蠟包埋,連續(xù)切片,片厚 4μm。

1.2 主要試劑

兔 5-LOX多克隆抗體,鼠 VEGF單克隆抗體,即用型非生物素免疫組化 Elivision TMplus檢測(cè)試劑盒,DAB染色劑等,均購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司。其他試劑取自大慶油田總醫(yī)院病理科。

1.3 試驗(yàn)方法

采用免疫組織化學(xué)Elivision法,操作參照檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行,用PBS液代替第一抗試劑作為陰性對(duì)照。

1.4 結(jié)果判定

5-LOX和VEGF染色陽(yáng)性產(chǎn)物為黃色或棕黃色顆粒,定位于細(xì)胞胞質(zhì)。在 200倍顯微鏡下觀察 5個(gè)不相重疊的視野,計(jì)數(shù) 100個(gè)細(xì)胞中陽(yáng)性細(xì)胞數(shù),凡染色強(qiáng)度高于視野者為陽(yáng)性表達(dá),將陽(yáng)性細(xì)胞按其數(shù)量及染色強(qiáng)度分級(jí):弱陽(yáng)性(+),陽(yáng)性細(xì)胞率 ＜10%,顯色強(qiáng)度為淡黃或僅個(gè)別細(xì)胞染色為棕黃色;中度陽(yáng)性(++),陽(yáng)性細(xì)胞率 10%～60%,顯色強(qiáng)度介于弱陽(yáng)性與強(qiáng)陽(yáng)性之間;強(qiáng)陽(yáng)性(+++),陽(yáng)性細(xì)胞率＞60%,多數(shù)細(xì)胞呈棕黃色;陰性(-)染色強(qiáng)度與背景無(wú)明顯差別。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用 SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理分析。采用χ2檢驗(yàn)及 Fisher精確概率法分析組間差異,Spearman等級(jí)相關(guān)分析分析 5-LOX與 VEGF的相關(guān)性,檢驗(yàn)水準(zhǔn):α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 5-LOX和VEGF在正常涎腺組織和涎腺腫瘤中的表達(dá)

5-LOX和VEGF染色陽(yáng)性產(chǎn)物為黃色或棕黃色顆粒,定位于細(xì)胞胞質(zhì)。5-LOX和VEGF表達(dá)水平涎腺惡性腫瘤組織明顯高于多形性腺瘤和正常組織(P＜0.05),見(jiàn)表 1。

表1 5-LOX與VEGF在涎腺腫瘤及正常涎腺組織中的表達(dá)情況(例)

2.2 5-LOX與 VEGF表達(dá)的相關(guān)性

涎腺組織中 5-LOX與 VEGF均表達(dá)陽(yáng)性 37例,均表達(dá)陰性19例,5-LOX表達(dá)陽(yáng)性而 VEGF表達(dá)陰性 8例,5-LOX表達(dá)陰性而 VEGF表達(dá)陽(yáng)性 16例。在涎腺良性腫瘤中,5-LOX和 VEGF表達(dá)水平均較低,而在涎腺惡性腫瘤中,兩者表達(dá)水平均較高,經(jīng)Spearman等級(jí)相關(guān)分析表明,5-LOX表達(dá)與 VEGF表達(dá)呈顯著正相關(guān)(γ=0.407,P＜0.05)。

3 討論

5-LOX是機(jī)體催化花生四烯酸生成生物活性分子白三烯的關(guān)鍵酶,普遍存在于哺乳動(dòng)物的各種組織和血液細(xì)胞中,其主要的生物學(xué)功能是催化花生四烯酸轉(zhuǎn)化為 5-羥過(guò)氧化二十碳四烯酸,后進(jìn)一步轉(zhuǎn)化成白三烯和 5-羥二十碳四烯酸(5-HETE)[1]。目前研究發(fā)現(xiàn),5-LOX及其主要下游產(chǎn)物 5-HETE和白三烯 B4(LTB4)在各種惡性腫瘤中高表達(dá),部分癌前病變亦有發(fā)現(xiàn)。Tong等[2]在胰腺癌的研究中發(fā)現(xiàn) 5-LOX的產(chǎn)物L(fēng)TB4可以通過(guò)誘導(dǎo) EPK 1/2磷酸化,從而促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞增值。由此推測(cè),5-LOX促癌作用可能與其代謝產(chǎn)物 5-HETE和LTB4有關(guān)。Ding等[3]研究發(fā)現(xiàn),5-LOX僅在胰腺癌細(xì)胞中表達(dá),而正常胰腺細(xì)胞中不表達(dá)。Nathoo等[4]研究發(fā)現(xiàn) 5-LOX在高分化的人星形細(xì)胞瘤組織中表達(dá)顯著高于低分化腫瘤的表達(dá),從而提示 5-LOX在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。本研究用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)5-LOX在涎腺腫瘤中的表達(dá),其陽(yáng)性表達(dá)率在涎腺惡性腫瘤組中比涎腺良性腫瘤組高,兩者表達(dá)水平有顯著性差異,涎腺良性腫瘤組又高于正常涎腺組織,兩者表達(dá)水平亦有顯著性差異。也說(shuō)明 5-LOX參與了涎腺腫瘤的惡性進(jìn)程,其過(guò)度表達(dá)與涎腺腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。

腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移依賴于新生血管形成,VEGF是 1個(gè)重要的血管新生誘導(dǎo)劑,它直接刺激內(nèi)皮細(xì)胞分裂增殖,是高度特異的血管內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂素,直接參與誘導(dǎo)血管生成,在腫瘤血管生成中起重要作用。目前認(rèn)為,VEGF在諸多促進(jìn)腫瘤血管生成的因素中起著最基礎(chǔ)、最關(guān)鍵的作用[5]。Romano等[6]發(fā)現(xiàn)人類惡性間皮瘤中,5-LOX的代謝產(chǎn)物 5-HETE可促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)轉(zhuǎn)錄,在惡性胸膜間皮細(xì)胞中用5-LOX反義核苷酸可以顯著降低 VEGFmRNA的表達(dá)量,同時(shí)促使細(xì)胞發(fā)生凋亡。而用 5-LOX cDNA轉(zhuǎn)染正常間皮細(xì)胞后,發(fā)現(xiàn) VEGF表達(dá)量顯著提高,提示 5-LOX及其產(chǎn)物可能通過(guò)VEGF途徑促進(jìn)腫瘤血管生成,從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。本研究中,VEGF陽(yáng)性表達(dá)率在涎腺惡性腫瘤組中明顯比涎腺良性腫瘤組高,兩者表達(dá)水平有顯著性差異,而涎腺良性腫瘤組又高于正常涎腺組織,兩者表達(dá)水平亦有顯著性差異,這一結(jié)果與Zhang等[7]報(bào)道的一致,說(shuō)明VEGF與腫瘤的惡性進(jìn)展密切相關(guān)。本研究中,在涎腺良性腫瘤中,5-LOX和VEGF的表達(dá)均較低,而在涎腺惡性腫瘤中兩者的表達(dá)均較高,VEGF表達(dá)與 5-LOX表達(dá)同步,兩者呈明顯正相關(guān),提示 5-LOX和 VEGF的高表達(dá)與涎腺腫瘤的惡性程度密切相關(guān),兩者協(xié)同作為涎腺腫瘤細(xì)胞增殖的調(diào)控因子,在涎腺腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起重要作用。

[1] 王 強(qiáng),羅運(yùn)春,周曉聰,等.n-3多不飽和脂肪酸對(duì)哮喘小鼠白三烯 B4及 5脂氧合酶基因表達(dá)的影響〔J〕.實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志,2007,23(8):1131.

[2] TongWG,Ding XZ,Hennig R,et al.Leukotriene B4 receptor antagonist LY 293111 inhibits proliferation and induces apoptosis in human pancreatic cancer cells〔J〕.Clin Cancer Res,2002,8(10):3232.

[3] Ding XZ,Tong WG,Adrian TE.Multiple signal pathways are involved in the mitogenic effect of 5(s)-HETE in human pancreatic cancer〔J〕.Oncology,2003,65(4):285.

[4] Nathoo N,Prayson RA,Bondar J,et al.Increased expression of 5-lipoxygenase in high-grade astrocytomas〔J〕.Neurosurgery,2006,58(2):347.

[5] Dankbar B,Padro T,Leo R,et al.Vascular endothelial growth factor and interleukin-6 in paracrine tumor-stromal cell interactions in multiplemyeloma〔J〕.Blood,2000,95(8):2630.

[6] RomanoM,Catalano A,Nutini M,et al.5-lipoxygenase regulatesmalignant mesothelial cell survival:involvement of vascular endothelial growth factor〔J〕.FASEB J,2001,15(13):2326.

[7] Zhang JL,Peng B,Chen XM.Expressions of nuclear factor kB,inducible nitric oxide synthase,and vascularendothelial growth factor in adenoid cystic carcinoma of salivarygland:Correlationswith the angiogenesis and clinical outcome〔J〕.Clin Cancer Res,2005,11(20):7334.