上海市農(nóng)科院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所 楊海鋒 趙志輝 顧賽紅 邢增濤

磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇是大豆磷脂中最重要的活性成分，其所占比重的高低，是衡量大豆磷脂品質(zhì)優(yōu)劣的一個(gè)重要標(biāo)準(zhǔn)（章慧芳和陸婭，2007）。隨著大豆磷脂市場(chǎng)需求的不斷擴(kuò)大，經(jīng)常發(fā)生大豆磷脂產(chǎn)品的貿(mào)易糾紛。廣大生產(chǎn)企業(yè)和用戶都希望對(duì)大豆磷脂中的有效成分磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇進(jìn)行檢驗(yàn)和檢測(cè)。國(guó)內(nèi)外研究報(bào)道的大豆磷脂的檢測(cè)方法主要是定磷法、薄層色譜法（TLC）、高效液相色譜法（HPLC）等（張穎穎等，2006；卜延剛等，2004）。定磷法需要消化、顯色等過(guò)程，操作繁瑣、耗時(shí)。薄層色譜法干擾因素多，靈敏度不高，顯色后定量誤差較大而主要用于定性分析。高效色相色譜法以其高速、高效、高靈敏度、系統(tǒng)封閉避免不飽和鍵氧化等優(yōu)點(diǎn)，受到普遍關(guān)注（董曉渭等，2000；Mounts和Nash，1990）。然而由于研究者應(yīng)用的前處理技術(shù)、檢測(cè)方法都不相同（張德權(quán)等，2006；Rombaut等 ，2005；Singleton 和 Stikeleather，1995；Becart等，1990），即使都使用HPLC技術(shù)，但分離柱、填料、流動(dòng)相也存在差異，缺乏一個(gè)統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。而不同的前處理方法和檢測(cè)技術(shù)會(huì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生一定的影響，因此迫切需要建立統(tǒng)一的飼料級(jí)大豆磷脂中主成分的檢測(cè)方法。本研究探討了應(yīng)用高效液相色譜法同時(shí)檢測(cè)飼料添加劑大豆磷脂中磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇的可行性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 實(shí)驗(yàn)中所用的大豆磷脂產(chǎn)品來(lái)自國(guó)內(nèi)6個(gè)主要大豆磷脂廠商的6個(gè)不同批次的產(chǎn)品，因此所選樣品具有廣泛的代表性。

1.2 試劑及儀器 正己烷：色譜純；異丙醇：色譜純；冰乙酸：色譜純；1%冰乙酸溶液：1 mL冰乙酸用色譜純水定容到100 mL；磷脂酰膽堿（PC）：標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，純度 ≥ 99%；磷脂酰乙醇胺（PE）：標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，純度 ≥ 99%；磷脂酰肌醇（PI）：標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，純度≥98%。高效液相色譜儀：配有四聯(lián)泵、柱溫箱、紫外檢測(cè)器（206 nm）。所用的磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇標(biāo)樣來(lái)源應(yīng)與所測(cè)定的樣品一致，如測(cè)定的樣品為大豆磷脂時(shí)，上述三種標(biāo)樣應(yīng)來(lái)源于大豆。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 精確稱取約20 mg磷脂酰膽堿、20 mg磷脂酰乙醇胺與10 mg磷脂酰肌醇，用正己烷∶異丙醇∶1%冰乙酸溶液為 8∶8∶1（V∶V∶V）混合溶液溶解并定容于10 mL容量瓶中搖勻，溶液中 PC、PE、PI濃度分別為 2、2 mg/mL 和 1 mg/mL。準(zhǔn)確吸取此溶液 0.25、1.25、2.50、3.75 mL 和 5.0 mL，并用正己烷∶異丙醇∶1%冰乙酸溶液為 8∶8∶1（V∶V∶V）混合溶液定容至5 mL，使溶液中磷脂酰膽堿的最終濃度為0.1～2.0 mg/mL、磷脂酰乙醇胺的最終濃度為0.1～2.0 mg/mL、磷脂酰肌醇的最終濃度為0.05～1.0 mg/mL。過(guò)0.45 μm孔徑濾膜。低于-16℃保存?zhèn)溆?，保存時(shí)注意容器口的密封。如標(biāo)樣為三氯甲烷或甲醇溶解的溶液，必須將其中的溶液用氮?dú)獯蹈?，再用流?dòng)相溶解定容。

1.4 試樣制備 依據(jù)樣品中磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇含量，稱取0.1～0.5 g（精確到0.0001 g）試樣，用正己烷∶異丙醇∶1%冰乙酸溶液為 8∶8∶1（V∶V∶V）混合溶液溶解并定容于 10 mL容量瓶中。于渦旋振蕩器上渦旋振蕩，混勻后，置超聲波清洗器中超聲30 min（期間每10 min取出混勻一次）。取少量試液于離心管中，以3600 r/min離心分離15 min，取2 mL上清液過(guò)0.45 μm孔徑濾膜，制得試樣待測(cè)液進(jìn)行色譜測(cè)定。低于-16℃保存?zhèn)溆?，保存時(shí)注意容器口密封。

1.5 液相色譜條件 硅膠柱：硅膠柱，長(zhǎng)250 mm，內(nèi)徑 4.6 mm，粒度 5 μm，或相當(dāng)者；柱溫：30 ℃；流動(dòng)相：正己烷∶異丙醇∶冰乙酸溶液為 8∶8∶1（V∶V∶V）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：206 nm；進(jìn)樣體積：10 μL。

1.6 液相色譜測(cè)定 用高效液相色譜儀分別對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品溶液和樣品溶液進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)定其色譜峰面積的響應(yīng)值，進(jìn)行定量計(jì)算。對(duì)同一樣品至少進(jìn)行兩次測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法重復(fù)性 結(jié)果見表1。由表1可見，本方法中磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇的測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于4%，因此應(yīng)用本檢測(cè)方法測(cè)定大豆磷脂中三種主成分含量有較好的精密度。

2.2 回收率 結(jié)果見表2。

對(duì)大豆磷脂樣品進(jìn)行添加回收試驗(yàn)，稱取約100 mg大豆磷脂樣品，用正己烷∶異丙醇∶1%冰乙酸溶液為 8∶8∶1（V∶V∶V）混合溶液溶解并定容至10 mL，稱取10 mg磷脂酰膽堿、10 mg磷脂酰乙醇胺、5 mg磷脂酰肌醇標(biāo)樣，用混合流動(dòng)相溶液溶解并定容于5 mL容量瓶中。分別取1 mL樣品溶液和1 mL的大豆磷脂標(biāo)樣溶液于5 mL容量瓶中定容，過(guò)0.45 μm膜，裝入樣品瓶?jī)?nèi)，待測(cè)，回收率計(jì)算公式如下：

表1 方法重復(fù)性試驗(yàn)

表2 樣品的回收率

回收率=（測(cè)定值-試樣中大豆磷脂含量）/添加大豆磷脂含量。

表2的測(cè)定結(jié)果表明，此方法中飼料級(jí)大豆磷脂三種主成分含量的回收率均在96%～103%，因此應(yīng)用本檢測(cè)方法測(cè)定大豆磷脂中三種主成分含量有較好的準(zhǔn)確度。

2.3 磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇同時(shí)測(cè)定 選用國(guó)內(nèi)6個(gè)不同廠家生產(chǎn)的大豆磷脂產(chǎn)品，測(cè)定其磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇含量，三者總和見表3?！睹绹?guó)中央大豆公司磷脂指南》中大豆磷脂的磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇含量分別約為16%、14%和9%，本試驗(yàn)結(jié)果與其基本相符。

表3 不同產(chǎn)品中磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇含量總和的檢測(cè)比較 %

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)中所采用的飼料級(jí)大豆磷脂中磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺和磷脂酰肌醇的高效液相色譜檢測(cè)方法，檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定、精確、可靠、可操作性強(qiáng)，為國(guó)內(nèi)飼料添加劑大豆磷脂產(chǎn)品中主要活性成分檢測(cè)提供很好借鑒。

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