農(nóng)業(yè)部畜禽產(chǎn)品質(zhì)量安全檢驗(yàn)測(cè)試中心（鄭州） 方忠意 劉素梅

地昔尼爾別名丙蟲啶，是一種體外殺蟲劑，對(duì)雙翅目昆蟲和蚤有高度殺滅作用，可阻止各種蠅、蚊及蚤的幼蟲發(fā)育成蛹和成蟲。但是動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，地昔尼爾對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物鼠具有DNA氧化損傷和致癌作用（Matsumoto等，2009；Umemura等，2007；Moto 等，2006），很多國(guó)家已經(jīng)制定了動(dòng)物食品中的最大殘留限量。最近發(fā)現(xiàn)有非法將地昔尼爾作為飼料添加劑用于飼料生產(chǎn)的現(xiàn)象，直接威脅到食品安全和我國(guó)的出口貿(mào)易，因此建立飼料中的地昔尼爾的檢測(cè)方法，對(duì)打擊非法使用藥物、維護(hù)我國(guó)飼料和畜產(chǎn)品安全有重要的作用。目前國(guó)內(nèi)外很少有地昔尼爾的檢測(cè)方法的報(bào)道。本研究通過對(duì)地昔尼爾化學(xué)性質(zhì)的分析和有關(guān)實(shí)驗(yàn)研究，建立了飼料中地昔尼爾的超高效液相色譜測(cè)定方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 Lambda 35雙光束紫外光譜儀；Waters Acquity UPLC超高效液相色譜儀 （帶紫外檢測(cè)器）；Heraeus離心機(jī)。

Waters Oasis MCX 萃取小柱 （3 mL，60 mg）。甲醇、乙腈、甲酸、乙酸銨等均為色譜純，其他試劑均為分析純；水為超純水。地昔尼爾對(duì)照品購(gòu)自德國(guó)Dr公司（批號(hào)為60606）。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液的配制 準(zhǔn)確稱取地昔尼爾標(biāo)準(zhǔn)品50 mg（精確至0.01 mg）于50 mL容量瓶中，加乙腈超聲溶解，放冷至室溫后用乙腈定容，配制成1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液；取適量的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液， 用流動(dòng)相配制成 0.05、0.1、0.5、1.0、10、50 μg/mL和 100 μg/mL系列標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3 吸光度的掃描 用乙腈將地昔尼爾標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液稀釋成濃度為10 μg/mL，用紫外分光光度計(jì)在200～500 nm掃描地昔尼爾的吸光度。

1.4 樣品處理 準(zhǔn)確稱?。?.00±0.02）g已粉碎好的飼料樣品，置于50 mL聚丙烯離心管中，加入20 mL乙腈，渦旋振蕩20 min，12000 r/min離心10 min。取5 mL上清液于15 mL離心管中，于50℃下氮吹濃縮至近干后加入3 mL 20%甲醇溶液（含0.2%甲酸），渦旋溶解殘?jiān)?，待凈化。將Waters Oasis MCX固相萃取小柱依次用3 mL甲醇、3 mL水活化后，加入待凈化的溶液，用3 mL水和3 mL甲醇淋洗后抽干，用3 mL 5%氨化甲醇洗脫，于50℃下氮吹濃縮至近干。準(zhǔn)確加入1.0 mL 30%甲醇溶液溶解，渦旋混勻30 s，過0.22 μm濾膜，濾液供超高效液相色譜儀測(cè)定。

1.5 色譜條件 色譜柱：Waters Acquity UPLCTMHSS T3柱（2.1 mm×100 mm i.d.，1.8 μm）；流動(dòng)相：甲醇-10 mmol/L 乙酸銨溶液（30+70，V/V）；流速：0.3 mL/min。 檢測(cè)波長(zhǎng)：270 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：2 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 吸收波長(zhǎng)的選擇 在200～500 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描地昔尼爾的吸光度曲線見圖1。從吸光度曲線上可以看出，地昔尼爾有2個(gè)吸收峰，其最大吸收波長(zhǎng)分別是222.60 nm和270.62 nm。雖然222.60 nm波長(zhǎng)的吸光度高于270.62 nm的波長(zhǎng)，但是飼料基質(zhì)復(fù)雜，基質(zhì)的吸收很容易影響地昔尼爾的檢測(cè)，所以本研究的檢測(cè)波長(zhǎng)選擇了270 nm。

圖1 地昔尼爾的吸收曲線圖

2.2 色譜條件的優(yōu)化 實(shí)驗(yàn)過程中，比較Waters Acquity UPLCTMBEH C18柱 （2.1 mm×10 mm i.d.，1.7 μm） 和 Waters Acquity UPLCTMHSS T3柱（2.1 mm×100 mm i.d.，1.8 μm）發(fā)現(xiàn)，地昔尼爾在C18柱保留較差，色譜峰拖尾；但在T3柱有很好的保留，色譜峰對(duì)稱性好。對(duì)甲醇和乙腈分別作為有機(jī)相時(shí)的分離效果進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)使用甲醇時(shí)地昔尼爾在色譜柱上保留較好；比較純水、10 mmol/L乙酸銨溶液分別作為水相，發(fā)現(xiàn)使用10 mmol/L乙酸銨作為水相時(shí)的色譜圖的基線噪音減小，色譜峰峰形得到改善。因此，實(shí)驗(yàn)最終采用“1.5”色譜條件，在該條件下得到的色譜圖。由圖2可知，在該色譜條件下，地昔尼爾色譜峰無(wú)雜質(zhì)峰干擾。

2.3 固相萃取柱的選擇 樣品凈化是對(duì)復(fù)雜基質(zhì)樣品檢測(cè)過程中的一個(gè)重要步驟。從地昔尼爾的分子結(jié)構(gòu)上可以分析出地昔尼爾是一種極性偏強(qiáng)的堿性化合物，實(shí)驗(yàn)過程中比較了C18、HLB和MCX三種不同類型的固相萃取柱的回收率，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，C18柱的回收率相對(duì)較差，這可能是地昔尼爾極性偏強(qiáng)，在C18柱上保留較差；HLB和MCX柱的回收率基本相當(dāng)，都達(dá)到95%以上，HLB柱能夠保留極性化合物，MCX柱能夠通過離子交換作用與地昔尼爾形成強(qiáng)有力的結(jié)合?？紤]到MCX柱凈化時(shí)專屬性更強(qiáng)，凈化效果更徹底，實(shí)驗(yàn)最終選擇了MCX柱。

2.4 方法的線性范圍、檢出限、回收率與精密度取系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按質(zhì)量濃度從低到高依次進(jìn)樣，以質(zhì)量濃度和峰面積做回歸曲線，得到地昔尼爾的回歸方程為y=41231x-856，相關(guān)系數(shù)為0.9999，線性良好。在空白飼料樣品中添加地昔尼爾標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行回收實(shí)驗(yàn)，方法檢出限（S/N=3）為 0.05 mg/kg，定量下限（S/N=10）為0.1 mg/kg。

取地昔尼爾陰性的豬飼料樣品，分別按樣品中10、50 mg/kg和200 mg/kg的含量水平添加一定量的地昔尼爾標(biāo)準(zhǔn)溶液，每一水平做5個(gè)平行，按上述試樣方法測(cè)定，回收率結(jié)果見表1。

3 小結(jié)

地昔尼爾質(zhì)量濃度在0.05～100 μg/mL內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)大于0.9999；在10～200 mg/kg的添加水平，平均加標(biāo)回收率為78.0%～86.3%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.2%～6.1%；方法的檢出限低至0.05 mg/kg，定量下限低至0.1 mg/kg。該方法簡(jiǎn)單、快速、靈敏，可滿足飼料中地昔尼爾的快速篩選檢測(cè)的要求。

表1 地昔尼爾的回收率和精密度（n=5）

[1]Matsumoto S，Jin M，Dewa Y，etal.Suppressive effect of Siraitia grosvenorii extract on dicyclanil-promoted hepatocellular proliferative lesions in male mice[J].J Toxicol Sci，2009，34（1）：109 ～ 118.

[2]Moto M，Okamura M，Muguruma M，et al.Gene expression analysis on the dicyclanil-induced hepatocellular tumors in mice[J].Toxicol Pathol，2006，34（6）：744 ～ 51.

[3]Umemura T，Kuroiwa Y，Tasaki M，et al.Detection of oxidative DNA damage，cell proliferation and in vivo mutagenicity induced by dicyclanil，a non-genotoxic carcinogen，using gpt delta mice[J].Mutat Res，2007，633（1）：46～54.