吳慧穎 張英杰

(商丘市人民醫(yī)院 河南 商丘 472000)

目前,冠心病依然是威脅人類生命的頭號殺手,缺血再灌注損傷成為阻礙缺血再灌注心肌從再灌注策略中獲得最佳療效的主要難題[1]。而抑制細胞凋亡能夠有效的抑制再灌注損傷[2]。已有的實驗和臨床研究證明,缺血預處理能夠減少心肌細胞凋亡,進而減輕心肌缺血再灌注損傷。由于患者發(fā)生缺血的時間無法預測,預處理在臨床應用中受到限制。苯那普利是血管緊張素轉換酶抑制劑第二代長效制劑,其通過抑制AngⅡ的生物學效應,對缺血再灌注心肌起保護作用[3]。本研究采用Langendorff離體灌注模型,觀察苯那普利后處理對大鼠心肌細胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

250～300g雄性SD大鼠32只(遼寧醫(yī)學院實驗動物中心提供),苯那普利純品(北京諾華制藥公司提供),核因子-κB免疫組化試劑盒(武漢博士德生物有限公司)。TUNEL試劑盒(武漢博士德公司分裝)。

1.2 方法

1.2.1 離體心臟缺血再灌注灌流模型建立[4]術前30min大鼠腹腔注射肝素(1000U/kg),3%戊巴比妥鈉(30mg/kg)腹腔注射麻醉后迅速開胸取心,主動脈插管懸掛于Langendorff灌流裝置上,灌流液為95%O2+5%CO2飽和的Krebs-Hanselet(KH)磷酸緩沖液,灌流壓70cmH2O,溫度穩(wěn)定在37℃。主動脈插管夾閉30min停止灌流,放開60min恢復灌流建立I/R模型。實驗分組:隨機等分為4組。對照組:KH液持續(xù)灌流110min。缺血再灌注組:KH液穩(wěn)灌20min,停灌30min,再灌60min。缺血預處理組:KH液穩(wěn)灌20min,連續(xù)3次停灌3min/復灌5min,停灌30min后再灌60min。苯那普利后處理組:KH液穩(wěn)灌20min,停灌30min,加入苯那普利(10～6mol/L)的KH液再灌15min,單純KH液再灌45min。

1.2.2 心肌損害病理學觀察 應用改良的Gonori變色酸亮綠特殊染色法(GCA)觀察I/R后心肌病理形態(tài)學改變。于試驗終點,速取左心室心尖部心肌,置于10%中性福爾馬林液中固定,制作石蠟切片。脫蠟至水,天青石藍及明礬蘇木素液先后重復染核,水洗、分化反藍,變色酸2R液及亮綠乙醇液重復染漿,脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片。結果判定,正常心肌纖維GCA染色呈綠色,紅細胞呈紅色或橘紅色,細胞核呈深藍色,心肌纖維呈深紅色為陽性。應用北京大恒圖像分析系統(tǒng),在光鏡下每張切片任選10個視野(×400),分析并計算深紅色面積占整個視野的百分比。

1.2.3 心肌組織NF-κB免疫組織化學染色 試驗結束,速取左室心尖相同部位的心肌,置于10%的中性福爾馬林溶液中固定,制作石蠟切片,脫臘,加入兔抗大鼠NF-κB多克隆抗體(1:100),4℃過夜,加入生物素化羊抗兔IgG,按照ABC法試劑盒操作,以PBS替代一抗作為空白對照,DAB顯色,蘇木精復染,常規(guī)脫水透明封片。結果判定:NF-κB免疫組織化學染色以心肌細胞核出現黃色或棕黃色顆粒為陽性。應用北京大恒圖像分析系統(tǒng),在光鏡下每張切片任意選取10個視野(×400),分析并計數NF-κB陽性表達細胞占整個視野的百分比。

1.2.4 心肌細胞凋亡率的測定 采用DNA原位末端缺口標記技術(TUNEL法)測定凋亡細胞。試驗結束,速取左室心尖相同部位的心肌,置于10%的中性福爾馬林溶液中固定,制作石蠟切片,按試劑盒說明行DNA原位末端缺口標記,DAB顯色,蘇木精復染。以未加末端脫氧核糖核酸轉移酶的標記溶液替換TUNEL混合液作陰性對照。凋亡細胞的細胞核被染成棕黃色或棕褐色,正常心肌細胞核被復染成藍色。在高倍鏡下(400×)觀察,根據凋亡陽性細胞分布情況,于凋亡陽性區(qū)域隨機選擇l0個視野,計數心肌細胞凋亡指數,即心肌凋亡陽性細胞數占總細胞數的百分比,以此反應凋亡程度。

1.2.5 統(tǒng)計學處理 用SPSS 12.0統(tǒng)計軟件進行分析,計量資料用表示,組間比較采用單因素方差分析,2組間比較用LSD檢驗。以P<0.05為差異有顯著性,以P<0.01為差異有非常顯著性。

2 結果

2.1 苯那普利后處理對缺血再灌注心肌損傷的影響

與對照組相比,I/R組心肌損害程度明顯增加(P<0.01),預處理組、苯那普利后處理組陽性面積增加(P<0.05);與I/R組相比,預處理組、苯那普利后處理組陽性面積縮小(P<0.01);苯那普利后處理組與預處理組2組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),見表1。

2.2 苯那普利后處理對NF-κB表達的影響

NF-κB陽性表達呈棕黃色顆粒,主要在胞核。NF-κB陽性表達百分率對照組為(10.98±3.65)%,I/R組NF-κB為(49.35±9.74)%,預處理組為(33.53±12.19)%,苯那普利后處理組為(34.77±4.66)%。與對照組相比,I/R組NF-κB陽性表達百分率顯著升高(P<0.01);與I/R組相比,預處理組、苯那普利后處理組均下調,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01);苯那普利后處理組與預處理組比較,陽性表達百分率無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表1 苯那普利后處理對缺血再灌注心肌損傷的影響(,n=8)

表1 苯那普利后處理對缺血再灌注心肌損傷的影響(,n=8)

注:與對照組相比★P<0.01,◆P<0.05;與I/R組相比▲P<0.01

2.3 苯那普利后處理對凋亡指數的影響

凋亡細胞的細胞核被染成棕黃色或棕褐色,正常心肌細胞核被復染成藍色。凋亡指數對照組為(5.81±1.43)%,I/R組為(18.51±2.52)%,預處理組為(13.52±2.31)%;苯那普利后處理組為(13.03±1.74)%。與對照組相比,I/R組 凋亡指數顯著升高(P<0.01);與I/R組相比,預處理組、苯那普利后處理組均下調,差異有顯著性(P<0.01);苯那普利后處理組與預處理組比較,凋亡指數無顯著性差異(P>0.05)。

3 討論

本研究結果顯示:與對照組相比,缺血再灌注組、缺血預處理組和苯那普利后處理組細胞凋亡率升高,心肌損傷程度加重;與缺血再灌注組比較,缺血預處理組和苯那普利后處理組細胞凋亡率明顯減低,心肌損傷程度減輕,提示苯那普利后處理對缺血再灌注損傷心肌有保護作用。而苯那普利后處理組與缺血預處理組相比無明顯差異,表明苯那普利后處理可誘導出預處理樣心肌保護作用。

NF-κB是一種具有基因轉錄多向調控作用的轉錄因子。其亦存在于心肌細胞中,參與心肌缺血-再灌注導致的心肌的炎性反應、凋亡、壞死和心功能下降等心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展[5]。本研究還發(fā)現,正常大鼠心肌組織有較少量的NF-κB表達,缺血再灌注60min后大鼠心肌組織中NF-κB的表達顯著上調,細胞凋亡率明顯升高,而苯那普利后處理組大鼠心肌在缺血再灌注60min組織中NF-κB表達則明顯低于缺血再灌注組,細胞凋亡率也明顯低于缺血再灌注組。因而推測苯那普利后處理具有減少心肌缺血再灌注后NF-κB的過度表達的作用,從而減輕心肌缺血再灌注后細胞凋亡的發(fā)生。具體中間機制尚有待進一步研究。

[1]Van Domburg RT,Sonnenschein K,Nieuwlaat R,et al.Sustained benefit 20 years after reperfusion therapy in acute myocardial infarction[J].J Am Coll Cardiol,2005,46(1):15～20.

[2]Zhao ZQ,Morris CD,Budde JM,et al.Inhibition of myocardial apoptosis reduces size and improves regional contractile dysfunction during reperfusion[J].Cardiovasc Res,2003,59(1):132～142.

[3]崔少波,劉仁光.苯那普利對離體大鼠缺血再灌注心肌的保護作用［J］.中國心血管雜志,2006,11(2):96～98.

[4]Curtis MJ,Macleod BA,Tabrizchi R.An improved perfusion apparatus for small animal hearts[J].1986,15:87～94.

[5]Jones WK,Brown M,Ren X,et al.NF-kappaB as an integrator of diverse signaling pathways:the heart of myocaedial signaling[J].Cardiovasc Toxicol,2003,3(3):229～254.